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微流控芯片下的单细胞轮廓定位与提取

2016-08-08夏海英肖雯静薛茗月

关键词:单细胞融合

夏海英,肖雯静,薛茗月

(1.广西师范大学电子工程学院,广西桂林541004; 2.广西师范大学化学与药学学院,广西桂林541004)



微流控芯片下的单细胞轮廓定位与提取

夏海英1,肖雯静1,薛茗月2

(1.广西师范大学电子工程学院,广西桂林541004; 2.广西师范大学化学与药学学院,广西桂林541004)

摘要:微流控芯片可实现单细胞分析,而对单个细胞分析,能够掌握更准确更全面的细胞信息,可以克服以往群体分析中平均结果对个别信息掩盖的局限性,对疾病的早期预防和诊断具有重要的科学意义。本文根据早期癌症细胞通过微流控芯片中的弯道时变形与正常细胞不同的理论,采用Grabcut和Snake相融合的单细胞图像分割算法来精确定位和提取单细胞轮廓,实现单细胞的形变分析。首先,本文在图像分割之前引入Perona-Malik模型,增强图像边缘的同时减弱噪声,使定位更加准确。其次,利用Canny和Snake模型获得Grabcut初始化矩形框。最后,通过Grabcut算法实时精确地提取单细胞轮廓。实验结果表明:本文算法结合了Snake算法和Grabcut算法的优点,在无人工交互的条件下,细胞轮廓平均正确分割率达到93.7%,能够满足医学单细胞分析的要求。

关键词:单细胞;轮廓定位与提取;Grabcut算法;Snake算法;融合

0引言

美国华盛顿大学的分析化学家NormanDovichi认为,在癌症的发展过程中, 同种细胞之间的蛋白质组分差异会越来越大。如果这种情况属实的话,细胞之间的巨大差异能够提示疾病更具有扩散的趋势。对单个细胞进行分析可以帮助研究人员区分单一细胞系种群和具有不同蛋白组分的多细胞系种群,这种区分差异的检测技术将对癌症、糖尿病等疾病的研究产生重要影响。2012年,Jason等人通过大量的实验分析,提出了早期癌症细胞在通过微流控芯片弯道时,与正常细胞的变形存在不同,并给出了理论分析,即细胞发生癌变后,细胞膜变厚[1]。但细胞图像分割具有边界模糊(甚至无边界信息)、内部灰度分布极其不均、纹理复杂等特点。那么对单个细胞轮廓的准确分析就变得相当重要。国内外的学者针对此问题也进行过很多研究。2008年Yangqihua等人提出基于Curvelet算法和Snake模型相结合的快速细胞轮廓提取算法[2],但是算法复杂程度高,实时性差;马竞锋等人利用伪中值双边滤波和水平集函数结合进行细胞分割[3],但细胞边缘分割效果精度较差,因为不是所有的细胞边缘都是规则圆润的;兰红等人提出分水岭优化的Snake模型肝脏图像分割,适用于腹部MR图像及肝脏图像等一些面积较大、特征较明显的图像[4-5],对细胞图像的提取分割精度较差;Rother等提出Grabcut算法以后,国内外学者为了得到更加精确的图像分割又对Grabcut算法进行了一系列的研究。陈浩等提出基于Grabcut和八方向链码法的藻类细胞轮廓提取算法[6],该算法能够屏蔽细胞内部杂乱的纹理,较好地保留图像边缘信息,但是用户交互复杂程度高,不适合细胞轮廓的实时提取;Tangchunming以遗传算法为基础提出植物茎细胞的精确轮廓提取[7],提取效果和细胞原图差异较大,不适用于医学图像的研究;陈林伟等人提出结合显著性的Grabcut及在骨髓细胞中的应用[8-9],算法能避免以往细胞分割算法,如支持向量机、K-means等参数调整问题,自动化程度显著提高,但分割效果精确性差且运行时间很慢,不能满足癌细胞的早期诊断要求。

考虑到当前细胞轮廓提取算法对于边界模糊、纹理复杂的细胞图不能够达到精确、实时的分割效果,本文提出以微流控芯片为主要平台,融合Snake模型的非交互Grabcut分割算法。该算法通过Snake算法快速定位单细胞的粗略位置,结合Grabcut算法实时精确提取单细胞轮廓。同时,为了消除图片中亮点噪声的影响,采用PM算法对原细胞图像进行处理,进一步提高了分割精确度。

1材料与方法

本文实验中所有样本均由广西师范大学化学与药学学院重点实验室提供。实验样本的获取以微流控芯片分析仪为实验平台,利用了微流控芯片技术以微管道网络为结构特征的特点和它在细胞学研究方面的优越性。单细胞成像分析时,采用类似于流式细胞仪进样方式,采样针下探接近装有细胞的试管底部,试管被加压, 样品开始流动。流动室有一方形通道,加压的鞘液流从低部进入该通道, 从上方流出。当鞘液流通过该通道时, 样品液被射入鞘液中间, 被鞘液流包围, 但不相互混合。鞘液流的压力使样品液流聚集, 鞘液裹挟着的样品流中的细胞排成单列, 微流控芯片的通道直径通常在10~100μm, 与单个生物细胞在尺度上具有相似性。细胞可逐个通过微流控芯片通道,到达检测窗口时被检测,并采集图片204幅,图片格式为BMP,大小为1 024×1 256像素。对其中的一部分细胞进行荧光染色(荧光染色是指细胞在荧光染料的作用下产生的荧光颜色),得到64幅染色后的图片。图1所示是单细胞成像分析进样系统示意图,图2是采集得到的单细胞图像。

图1 单细胞成像分析进样系统示意图(流式细胞进样)Fig.1 Single cell imaging analysis injection system diagram

图2 微流控芯片下采集到的单细胞图像Fig.2 Single cell image acquisition

2融合Snake的Grabcut细胞轮廓自动提取算法

首先,采用PM模型对图像进行平滑和去噪;其次,用Canny和Snake结合的算法实现单细胞图像的粗定位;最后,利用细胞轮廓的粗定位对Grabcut算法初始化,使得本方法不仅能够得到准确的单细胞轮廓,而且满足了实时性要求。具体算法流程如下:

目标:经过多次迭代使得对背景和目标建模的GMM参数最优,从而使能量E(α,k,θ,z)最小化(见公式(1))得到最优分割效果。

E(α,k,θ,z)=U(α,k,θ,z)+v(α,z),

(1)

式中:U为区域项;v为彩色图像平滑项;α为不透明度,α∈[0,1],0为背景,1为前景目标;θ为本幅图像前景目标与背景的灰度直方图,θ={h(z,α),α=0,1};z为图像灰度值数组[8]。

Step1:自动生成初始化矩形。

①利用PM模型对原始图像进行平滑,增强边缘,去除噪声。

②为了防止图像中的噪声点会误导Snake朝其移动,使Snake被吸引到虚假边缘处,对去噪后的图像利用Canny边缘检测算子进行细化边缘,生成一副与原图像大小相同的二维灰度图像。

③根据②中Canny得到的细化边缘估计Snake的初始蛇点,然后依据Snake模型的原理进行迭代运算(见公式(2)),当新蛇相对于旧蛇没有变化时,即Eint=Eimage,则停止迭代,最终得到一系列连续点组成的细胞初始轮廓线。

(2)

其中:Eint表示主动轮廓的内部能量,用来控制Snake的能量向内部收缩;Eimage表示外部能量,用来将Snake曲线吸引到图像明显的外部特征上,在分割过程中起到了重要的作用。

图3 算法流程图Fig.3 Algorithm flowchart

④按从上到下的顺序逐行扫描,获得③中组成初始轮廓线的所有点的坐标。经过对比,分别找出x、y轴上坐标最小的点作为矩形框的左上角的点,同理,找出x、y轴上坐标最大的点作为矩形框的右下角的点,然后把(x.max-x.min)、(y.max-y.min)分别作为框的长和宽画矩形。

⑤得到的矩形框匹配原来在图像上手动选定约束矩形框可以实现自动标注的目的,框外的区域为背景区域Tb,框内的区域为未知区域Tu,Tf为目标区域。

⑥Tb内的像素点的α值为0,Tu内的为1,Tf则设为空。

Step2:微流控芯片技术下单细胞的轮廓提取。

①通过k-means算法初始化前景与背景的GMM模型,每组高斯混合模型的高斯函数分量为5。

②把每个像素分配到合适的GMM模型中,分配原则是将每个像素代入到每个高斯分量中,最小值所在的高斯分量就是该像素对应的那个分量kn(见公式(3))。

D(αn,kn,θ,zn)=-logp(zn|αn,kn,θ)-logv(αn,kn),

kn=argminDn(αn,kn,θ,zn),

(3)

其中p(·)是高斯概率分布,v(·)是该高斯模型的样本数在总样本中的权值。

③学习优化GMM的参数θ(见公式(4))。

θ=argminU(α,k,θ,z)。

(4)

⑤重复步骤②~④,直到收敛,GMM参数确定。

⑥采用bordermatting对分割边界进行优化,就可以得到目标的分割结果。

依据以上算法步骤,可以得到融合Snake的Grabcut细胞轮廓自动提取算法的流程图(如图3所示)。

3实验结果及分析

为了评估本文算法的性能,将本文算法和Snake模型、Grabcut算法在2种细胞图像集中进行对比分析。实验一的单细胞图像采自标准细胞图像库(http://www.cellimagelibrary.org/images),实验二的单细胞图像采自微流控芯片实验平台,实验三是对3种算法分割效果的定量实验分析。其中实验一、二是在WindowsXP操作系统平台上,采用VS2010工具和Opencv相结合实现的。实验时将Canny算子的上下限分别设置为15、40,Grabcut算法的迭代次数均设为5。实验三是在Matlab2011b实验平台下得到的仿真结果。

3.1标准细胞库下单细胞图像分割

我们共对标准细胞库50幅单细胞图片进行了性能测试,图4是对标准细胞库网站上的细胞进行测试的结果:前3列是干净背景下的细胞图,后2列是复杂背景下的细胞图。

分析以上实验结果可知,Snake算法运用在细胞轮廓提取上易受虚假边缘的干扰,检测精确度较低。grabcut算法容易出现欠分割现象。本文改进算法能到达到最佳分割效果(如图4(a)、(b)、(c)、(d))。但是,在细胞图背景极复杂且包含大量轮廓时本文算法的精确度将有所下降(如图4(e))。

(a)为早期胚胎细胞;(b)为骨髓细胞;(c)为受精卵细胞;(d)为真核细胞;(e)为肌细胞。图4 标准细胞库内单细胞轮廓提取结果对比Fig.4 Single cell of Standard cell library contour extraction results contrast

3.2微流控芯片技术下单细胞图像分割

实验二包括60幅单细胞图,图5是对在微流控芯片平台下采集得到的细胞图像进行测试的结果:其中30幅染色的单细胞(如图5前3列),30幅非染色细胞图(如图5后2列),

(a)、(b)、(c)为染色单细胞,(d)、(e)为未染色单细胞。图5 微流控芯片下单细胞轮廓提取结果对比Fig.5 Single cell contour extraction results contrast of microfluidic chips

图5实验结果可知,Snake模型容易出现细胞边缘检测断裂、不能够完整检测出边缘的问题,Grabcut算法需要用户交互操作,易受到用户主观意思的影响分割出错误的细胞边缘。本文算法能够实现非交互的自动分割,分割单细胞图像的精度大大提高(如图5(a)、(b)、(c)、(d))。但是,当细胞图像受到光照不均匀等问题的影响时,本文算法的分割精度将有所下降(如图5(e))。

3.3分割算法性能评估

为了进一步评价算法分割效果,本文对标准细胞库下采样的30幅图片和微流控芯片技术下采样的30幅图片又分别进行实验效果分析,并通过3个指标比较分割性能。

过分割率yOR=Qp/Dp,

欠分割率yUR=Up/Dn,

总体误差率yER=(Qp+Up)/(Dp+Dn)。

(5)

其中:Qp表示本来属于该类但没有分到此类的数据点;Dp表示属于此类的数据点数;Dn表示不属于此类的数据点数;Up表示本来不属于该类但错误地分到此类的数据点数。把30幅图像用4个方法进行分割后的效果进行定量分析,其过分割率、欠分割率、总体误差率对比结果见图6。

通过以上分析可以发现,对大部分标准细胞图(尤其是干净背景的单细胞图)而言,本文算法和Grabcut算法分割效果相当,都能够得到较好的实验效果,但对于背景复杂和微流控芯片下采集到的单细胞图而言,本文算法和Snake算法相比,3个指标都显著降低;和Grabcut算法相比,其过分割率相当,但在欠分割率上本文算法明显低于Grabcut算法。由以上数据综合分析可知本文算法的平均总体正确率达到93.7%,在4种算法中最高效果最好,能够达到医学图像分析的要求。

图6 3种分割算法的定量分析对比图Fig.6 Quantitative analysis of three kinds of segmentation algorithm comparison chart

4结论

本文以微流控芯片为研究平台,以实时获取单细胞轮廓为研究目的,提出了融合Snake的Grabcut细胞轮廓自动提取算法。此算法改进了传统的Grabcut算法在单细胞轮廓提取中自动化程度低、分割结果易受亮点噪声影响等缺点。首先采用Perona-Malik[10]算法对单细胞图像进行平滑的同时增强细胞边缘,然后利用Canny和Snake模型逼近细胞边缘获得Grabcut初始化矩形框。大量的实验结果表明:本文算法分割精确度显著提高,尤其对于在微流控芯片分析仪下采集得到的细胞图效果更加明显。所以,能够满足单细胞医学图像分析。但是如果单细胞图像光照不均匀、背景非常复杂且有大量轮廓时,本文算法效果将有所下降,还需要更深入的研究。

参考文献:

[1]JASONPB,STEFANHH,KARLA,etal.Sortingcellsbysize,shapeanddeformability[J].LabonaChip, 2012,12(6):1048-1051.

[2]YANGQihua,WANGQiang.Tissuecellboundariesdetectionbasedoncurvelet-basedsnakemodelinelectrorotationbio-chipcontrolsystem[J].IEEEComputerSociety,2008(2):728-732.

[3]马竟锋.细胞图像主动轮廓分割模型研究[D]. 杭州:浙江大学,2011.

[4]兰红,张璐.分水岭优化的Snake模型肝脏图像分割[J].中国图像图形学报,2012,17:873-897.

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[6]CHENHao.Algaecellcontourextractionalgorithmbasedongrabcutandthe8-directionchaincodeedgetrackingmethod[J].JournalofMechanicalandElectricalEngineering,2010,27(8):108-111.

[7]TANGChunming.Accurateextractionofcontourinformationfromthecleavageofneuralstemcells[C]//BiomedicalandPharmaceuticalEngineering.Singapore:IEEE, 2006:67-72.

[8]陈林伟,吴向平. 结合显著性的GrabCut及在骨髓细胞图像分割中的应用[J].中国计量学院,2014,25(1):87-92.

[9]刘毅. 基于图割的交互式图像分割算法研究[D].南京:南京理工大学,2013.

[10]辛巧,闫萍,盛其荣.基于高斯曲率改进的PM模型[J].广西师范大学学报(自然科学版),2007,25(2):194-197.

(责任编辑马殷华)

doi:10.16088/j.issn.1001-6600.2016.02.008

收稿日期:2015-12-15

基金项目:国家自然科学基金资助项目(21327007);广西自动检测技术与仪器重点实验室基金项目(YQ1402);广西高等学校科研资助项目;广西师范大学博士启动基金资助项目

中图分类号:TP39

文献标志码:A

文章编号:1001-6600(2016)02-0054-07

SingleCellContourLocalizationandExtractionunderMicrofluidicChip

XIAHaiying1,XIAOWenjing1,XUEMingyue2

(1.CollegeofElectronicEnginneering,GuangxiNormalUniversity,GuilinGuangxi541004,China;2.SchoolofChemistryandPharmacenticalSciences,GuangxiNormalUniversity,GuilinGuangxi541004,China)

Abstract:The single-cell analysis, achieved on the microfluidic chip, is able to grasp more accurate and comprehensive cells information, has important scientific significance for the prevention and early disease diagnosis. Based on the theories that the deformability of the early cancer cells are different from normal cells when they go around a curve in the microfluidic chip. So a new cell segmentation algorithm, which fuses classical grabcut algorithm with snake algorithm, is proposed to accurately extract a single cell outline, and achieve the deformation analysis of a single cell. Firstly, the morphological operators are used to eliminate small bright spot noise. Secondly, canny and snake algorithm are utilized to get the position of one cell, which can be regarded as the initialization of the grabcut algorithm. Finally, accurate cell contour are extracted by grabcut algorithm. Experimental results show that the proposed algorithm combines the advantages of snake algorithm and grabcut algorithm. In the absence of human interaction, the average correct segmentation rate is up to 93.7%, can meet the medical requirements of single cell analysis.

Keywords:unicellular; contour localization and extraction; Grabcut algorithm; Snake algorithm; fuse

通信联系人:夏海英(1983—),女,山东聊城人,广西师范大学副教授,博士。E-mail:xhyhust@gmail.com

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