孔祥鹏　刘志华　刘雪峰　刁桂萍

(东北林业大学，哈尔滨，150040)



棘孢木霉ACCC30536葡聚糖酶基因的克隆及表达1)

孔祥鹏刘志华刘雪峰刁桂萍

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

摘要以棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ACCC30536菌株为试材，采用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆获得葡聚糖酶GH71基因的全长cDNA序列。结果表明：此基因的cDNA 编码区序列全长1 296 bp，编码区可编码431个氨基酸。经BlastP相似性分析，其属于GH99～GH71超家族，与深绿木霉(T. atroviride)氨基酸序列XP_013941146的同源性最高，达到94%。7种不同诱导条件下，GH71基因的表达量变化明显。在2种病原菌细胞壁的诱导下，GH71基因的表达均呈先上升后下降又上升的趋势，在培养的12 h时达到最大值，分别为未诱导时的24.3倍和23.9倍。而在这2种病原菌发酵液的诱导下，GH71基因的表达均呈先下降后上升的趋势。在山新杨茎与叶的诱导下，GH71基因的表达量在24 h最大，分别为未诱导的25.4倍和25.2倍；在山新杨根的诱导下，GH71基因的表达量在48 h达到最大，是未诱导的28.1倍。

关键词棘孢木霉；葡聚糖酶；诱导表达

木霉菌(Trichodermaspp.)因其能抑制多种病原真菌、促进植物生长、诱导其免疫能力，且兼具降解土壤中盐类化合物、农药残留物及重金属离子等功能，而被广泛应用于农林业中[1-2]。经研究发现，木霉菌中含有种类丰富的葡聚糖酶，包括α-1,3葡聚糖酶、β-1,3葡聚糖酶和β-1,6葡聚糖酶[3]。这些葡聚糖酶是木霉产生的非常重要的抑菌蛋白之一，它们通过与其它酶类或是抗生素的协同作用起到抑菌的功效。有研究表明，绿色木霉(Trichoderma virens)中的β-1,3葡聚糖酶TvBgn2和β-1,6葡聚糖酶TvBgn3，能提高木霉对多种病原真菌的拮抗能力[4-5]。哈茨木霉(T. harzianum)CECT2413中的β-1,6葡聚糖酶，能降解病原真菌细胞壁，在其重寄生于病原真菌的过程中起重要作用[6]。棘孢木霉(T. asperellum)和哈茨木霉中的β-1,3葡聚糖酶，也被证明在木霉寄生病原真菌的过程中起作用[7]。而关于α-1,3葡聚糖酶在木霉菌行使生防功能过程中所起的作用，尚不明确。本研究采用聚合酶链式反应(PCR)技术，获得了棘孢木霉ACCC30536中葡聚糖酶GH71基因的cDNA全长；并研究了7种不同诱导条件下葡聚糖酶基因GH71的表达情况，可为今后进一步研究棘孢木霉中葡聚糖酶的生防功能、利用木霉菌开发更有效的生防制剂提供参考。

1材料与方法

棘孢木霉ACCC30536菌株购于中国农业微生物菌种保藏管理中心；引物由上海生工生物有限公司合成。

对已构建的棘孢木霉ACCC30536菌株转录组基因序列进行生物信息学分析，获得棘孢木霉葡聚糖酶GH71基因的全长cDNA序列。

用ORFfounder确定棘孢木霉葡聚糖酶GH71基因的开放读码框；通过BlastP预测保守区，寻找相似性序列；通过ClustalW软件进行多序列比对；使用MEGA5.0软件构建进化树；用SignalP4.1预测蛋白质信号肽；使用ExPASy-ProtParam软件分析蛋白质的等电点和相对分子质量等信息；用ProtScale预测蛋白疏水性。

培养基：杨树病原菌发酵液诱导培养基为MM基础培养基(去除葡萄糖)+10%杨树烂皮病病原菌发酵液(或杨树叶枯病病原菌发酵液)；杨树病原菌细胞壁诱导培养基为MM基础培养基(去除葡萄糖)+1%杨树烂皮病病原菌细胞壁(或杨树叶枯病病原菌细胞壁)；山新杨根粉诱导培养基为MM基础培养基(去除葡萄糖)+1%山新杨根粉；山新杨茎粉诱导培养基为MM基础培养基(去除葡萄糖)+1%山新杨茎粉；山新杨叶粉诱导培养基为MM基础培养基(去除葡萄糖)+1%山新杨叶粉。

将棘孢木霉ACCC30536接种于1/2PDA斜面培养基中，28 ℃恒温培养5d后收集孢子，并用血球计数板计数。将106个/mL棘孢木霉孢子接种于180mL1/4PD培养基中，28 ℃、200r/min培养24h后，将菌丝体转接入上述7种培养基中进行诱导培养，分别于0、12、24、48、72h收集菌丝体(重复3次)。

对收集的不同诱导条件下的菌丝体进行总RNA提取和消化DNA。以消化后的RNA为模板，用大连宝生物公司反转录试剂盒合成cDNA。以稀释10倍后的不同cDNA为模板，用4组引物(见表1)进行RT-qPCR，反应条件：95 ℃预变性30s，95 ℃ 5s，59 ℃ 15s，72 ℃ 10s，81 ℃读板1s，45个循环。采用2-ΔΔCt计算法[8]对数据进行分析处理。

表1　RT-qPCR引物

2结果与分析

2.1棘孢木霉葡聚糖酶基因全长cDNA获得及序列分析

从棘孢木霉ACCC30536菌株克隆得到葡聚糖酶基因的cDNA序列，全长1 296bp，编码区可编码431氨基酸。ProtParam预测表明，该蛋白的相对分子质量为47 190，理论等电点为5.18。通过BlastP对葡聚糖酶基因编码的氨基酸序列进行保守区预测(见图1)，该蛋白属于GH99～GH71超家族。采用SignalP软件对GH71蛋白进行信号肽分析(见图2)，该蛋白在23位与24位氨基酸之间含信号肽，信号肽剪切位点是TFA-DE，说明该蛋白是分泌到细胞外起作用。通过ProtScale软件对葡聚糖酶进行疏水性分析(见图3)，氨基酸残基的疏水性(正值表明疏水，负值表明亲水)平均值为-0.114，表明该蛋白具有亲水性。

图1　葡聚糖酶的保守区域预测

所标示位置为信号肽剪切位点。

通过NCBI的BlastP对GH71基因进行同源性搜索，在GenBank的数据库中与棘孢木霉葡聚糖酶基因GH71的氨基酸序列匹配的序列共有104个，同源性为41%～94%，与深绿木霉(T. atroviride)氨基酸序列XP_013941146的同源性最高，达到94%。选取与GH71基因的氨基酸序列相似性较高的6个木霉属葡聚糖酶氨基酸序列，用ClustalW进行多序列比对(见图4)，该蛋白酶包含2个功能域：羧基端多糖结合域、氨基端催化域。

图3　葡聚糖酶GH71的疏水性分析

KUE94741为盖姆斯木霉(Trichoderma gamsii)；XP_013941146为深绿木霉(Trichoderma atrovirideIMI206040)；ETS03510为里氏木霉(Trichoderma reeseiRUTC-30)；XP_006964349为里氏木霉(Trichoderma reeseiQM6a)；XP_013956802为绿色木霉(Trichoderma virensGv29-8)；KKO98433为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。

图4不同葡聚糖酶氨基酸序列多序列比对

将棘孢木霉ACCC30536葡聚糖酶基因GH71的氨基酸序列，与其它6种来源于木霉属的氨基酸序列用MEGA5.0进行进化树分析(见图5)，棘孢木霉ACCC30536葡聚糖酶GH71氨基酸序列与来源于深绿木霉的葡聚糖酶(XP_013941146)氨基酸序列的亲缘关系近(BranchⅠ)。

2.2棘孢木霉GH71基因的诱导表达

由表2可见：在杨树烂皮病与杨树叶枯病2种病原菌细胞壁的诱导下，棘孢木霉葡聚糖酶基因GH71的表达呈先上升后下降又上升的趋势，均是在培养的12h时达到最大值，分别为未诱导时的24.3倍、23.9倍。在杨树烂皮病病原菌发酵液的诱导下，该基因在培养的72h内均呈先下降后上升的表达趋势，在培养的72h，GH71的表达量最大，为未诱导时的24.9倍。在杨树叶枯病病原菌发酵液的诱导下，GH71的表达也呈先下降后上升的趋势，在培养的24h时GH71的表达量最低；而在诱导72h时表达量最高，为未诱导时的22.8。在山新杨根、茎、叶的诱导下，GH71的表达为先上升后下降的趋势，其中：在山新杨茎与叶的诱导下，GH71的表达量在24h最大，分别为未诱导的25.4倍、25.2倍；而在山新杨根的诱导下，GH71的表达量在48h达到最大，是未诱导的28.1倍。

3结论与讨论

本研究克隆了棘孢木霉ACCC30536菌株中葡聚糖酶GH71基因的全长cDNA序列，全长为1 296bp，可编码431个氨基酸，合成的蛋白相对分子质量为47 190，理论等电点为5.18。通过预测得知，该蛋白属于GH99～GH71超家族。有研究显示，拮抗菌可通过分泌葡聚糖酶分解病原菌细胞壁来抑制其生长[9]。本试验在棘孢木霉与病原真菌互作过程中发现，在杨树烂皮病和杨树叶枯病2种病原菌细胞壁的诱导前期，棘孢木霉中的葡聚糖酶基因GH71上调表达，说明该基因在木霉与病原真菌互作过程中起到分解病原菌细胞壁的作用。在病原菌发酵液诱导前期，棘孢木霉葡聚糖酶基因GH71的表达量减少，但随着诱导时间的加长，GH71表达量开始上升；这表明，棘孢木霉GH71基因不仅能在木霉分解病原真菌细胞壁的过程中起作用，还能帮助木霉抵御病原真菌发酵液的毒害。此外，在棘孢木霉与杨树根、茎、叶互作的试验中，显示GH71基因均呈上调表达的趋势。以上结果说明，棘孢木霉ACCC30536菌株不仅能与杨树病原菌互作，也能与杨树进行互作，并且在互作过程中GH71基因可上调表达。本研究结果，可为今后进一步利用葡聚糖酶进行杨树及木本植物病害防治提供参考。

节点旁数字代表1000个重复中引导支持百分比；比例尺0.2代表20%的氨基酸是不同的；Branch I、Branch II、Branch Ⅲ代表不同的分支。

诱导培养棘孢木霉葡聚糖酶基因GH71的相对表达水平处理12h处理24h处理48h处理72h杨树烂皮病病原菌发酵液-1.786±0.012-1.536±0.0330.491±0.1034.719±0.071杨树叶枯病病原菌发酵液-0.109±0.241-1.633±0.1531.704±0.0252.794±0.047杨树烂皮病病原菌细胞壁4.359±0.1582.324±0.0721.726±0.0182.587±0.049杨树叶枯病病原菌细胞壁3.867±0.0490.631±0.1501.638±0.2464.262±0.052山新杨叶粉4.156±0.2425.240±0.0842.972±0.0503.283±0.036山新杨茎粉3.410±0.0135.487±0.0903.037±0.1262.342±0.047山新杨粉根5.120±0.1717.167±0.0408.108±0.1134.793±0.029

注：表中数据为“平均值±标准差”。

参考文献

[1]宋晓妍，孙彩云，陈秀兰，等.木霉生防作用机制的研究进展[J].中国农业科技导报，2006，8(6)：20-25.

[2]遇文婧.深绿木霉刺激植物响应蛋白TatEpl1诱导杨树系统抗病性机制[D].哈尔滨：东北林业大学，2015.

[3]杨合同，郭勇，李纪顺，等.木霉菌产生的葡聚糖酶和植物病害防治[J].山东科学，2003，16(4)：1-7.

[6]TSENGSC，LIUSY，YANGHH，etal.ProteomicstudyofbiocontrolmechanismsofTrichoderma harzianumETS323inresponsetoRhizoctonia solani[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry，2008，56(16)：6914-6922.

[7]QUALHATOTF，LOPESFA，STCINDORFFAS，etal.MycoparasitismstudiesofTrichodermaspeciesagainstthreephytopathogenicfungi:evaluationofantagonismandhydrolyticenzymeproduction[J].BiotechnologyLetters，2013，35(9)：1461-1468.

[8]LIVAKKJ，SCHMITTGENTD.Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2(-DeltaDeltaC(T))Method[J].Methods，2001，25(4)：402-408.

[9]VITERBOA，RAMOTO，CHERNINL，etal.SignificanceoflyticenzymesfromTrichodermassp.inthebiocontroloffungalplantpathogens[J].AntonievanLeeuwenhoek，2002，81(1)：549-556.

第一作者简介：孔祥鹏，男，1990年11月生，东北林业大学林学院，硕士研究生。E-mail：656790783@qq.com。 通信作者：刁桂萍，东北林业大学林学院，副教授。E-mail：dgp2003@126.com。

收稿日期：2016年5月12日。

分类号Q933

CloningandDifferentialExpressionofAGlucanaseGenefromTrichoderma asperellumACCC30536//

KongXiangpeng,LiuZhihua,LiuXuefeng,DiaoGuiping

(NortheastForestryUniversity,Harbin150040,P.R.China)//JournalofNortheastForestryUniversity，2016,44(8)：108-111.

WeclonedandisolatedthecDNAofglucanase(GH71)genefromTrichoderma asperellumACCC30536.ThecDNAsequenceofGH71was1 296bpinlength,encoding431aminoacids.BlastPsearchindicatedthatGH71belongedtoGH99-GH71-likesuperfamilyanditshowedthehighestsimilarity94%withaproteinofT. atroviride (XP_013941146).Moreover, GH71wasproventobedifferentiallytranscribedundersevendifferenttreatments. GH71transcriptswereup-regulatedintheconditionsofinducingboth1% Alternaria alternatacellwalland1%Cytsporachrysospermacellwallwithpeaktranscriptionlevelsof24.3and23.9timesat12h,respectively.Whileundertheconditionsof10% A. alternatafermentationliquidandC. chrysospermafermentationliquid,thetranscriptsofGH71weredown-regulatedatfirstandthenup-regulated. GH71transcriptionwasup-regulatedby1%leafandstempowderofPopulus dividiana×P. bolleanawithpeaktranscriptionlevelsof25.4and25.2timesat24h,respectively.ThetranscriptofGH71wasalsoup-regulatedby1%rootofPopulus dividiana×P. bolleana,withpeaktranscriptionlevelsof28.1timesat48h.

KeywordsTrichoderma asperellum； Gluncanase； Differential expression

1)中央高校基础科研业务费专项资金项目(2572014BA08)；中国博士后科学基金面上项目(20110491014)；哈尔滨市青年科技创新人才项目(2013RFQXJ02)。

责任编辑：张玉。