张涛++韩梅++刘翠晶

摘要：研究人参皂苷生物合成途径中的影响因子。以五年生人参根组织为试验材料，提取总RNA，反转录合成cDNA的第1条链，利用PCR法对人参中的原人参三醇合成酶（CYP716A53v2）基因的cDNA进行克隆及序列分析。获得CYP716A53v2基因全长片段为1 506 bp，开放阅读框长1 410 bp，编码470个氨基酸多肽。生物信息学分析显示，CYP716A53v2基因编码蛋白质不含跨膜区域。 说明CYP716A53v2基因与其他植物氨基酸序列具有较高同源性，其中与人参、西洋参、三七同源性分别为99%、98%、98%。

关键词：人参皂苷；基因克隆；序列分析

中图分类号： S567.5+10.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0053-04

收稿日期：2015-05-05

基金项目：国家自然科学基金（编号：31270371）；国家科技支撑计划（编号：2011BAI03B01-02）。

作者简介：张涛（1991—），男，硕士研究生，主要从事药用植物分子生态学。E-mail：251073371@qq.com。

通信作者：韩梅，教授，主要从事药用植物资源与药材质量评价。E-mail：hanmei77@sohu.com。人参（Panax ginseng C.A.Meyer）为五加科人参属名贵药材，自古以来是中国重要药用植物，有“百草之王”的美誉。现代药理学研究表明，人参皂苷为人参主要药效成分，按苷元基本骨架可分为齐墩果烷型和达玛烷型，属于三萜类化合物。目前，已从人参中分离得到约 90 种人参皂苷单体[1-3]。抗癌活性成分人参皂苷Rg3已经于2000年批准为一类新药[4]；随着老龄化人口增加和疾病的改变，如心血管疾病和肿瘤人口的增加，人参皂苷Rg和Re被命名为血管生长因子。人参皂苷含量和组成是人参质量的重要指标，人参皂苷的含量较低，人工合成次生代谢产物人参皂苷尚未实现，对于一些含量甚微的单体皂苷的新药开发还较为困难。人参皂苷的生物合成途径与功能基因的表达量之间的关系仍处于探究阶段。深入了解人参皂苷生物合成途径及其调控机理，在分子水平上实现人参皂苷的人工合成，这将是利用生物技术手段大量生产人参皂苷的必然前提。

原人参三醇合成酶（CYP716A53v2）是达玛烷型人参皂苷合成的重要调控酶，原人参三醇合成酶催化原人参二醇到原人参三醇的过程，相关试验研究认为，细胞色素P450 CYP716A53v2基因mRNA表达量与三萜皂苷的生成量呈正相关[5]。本试验对人参皂苷生物合成途径中的细胞色素P450 CYP716A53基因进行了克隆与序列分析，目的在于从基因水平研究人参皂苷生物合成途径的调控机制，实现三萜皂苷基因的高效表达，增加人参药材的药效成分含量，提高人参药材质量和经济价值，为实现未来药材质量安全、可控、稳定、有效的发展目标提供理论依据。1材料与方法

1.1材料

五年生鲜人参取自吉林省抚松县抚南林场，位于 42°03′06″N、127°33′21″E，海拔903 m，用刀将根部切成小块放入冻存管迅速用液氮冷冻于-80 ℃保存待用，试验所用部位为人参根组织。

1.2主要试剂和仪器

植物总RNA提取试剂盒，2×Power Taq PCR Mastermix，凝胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒，DNA 连接试剂盒等均购自北京百泰克生物科技有限公司；PrimeScript Reverse Transcriptase 反转录试剂盒，LB 培养基，JM109 感受态菌株均购自大连宝生物工程有限公司。Eppendorf Mastercycler nexus PCR仪，德国；DYY-8C琼脂糖凝胶电泳仪，北京六一；GIS-2010凝胶成像系统，上海Tanon；HC-2518R高速冷冻离心机，MDF-382E超低温冰箱，日本SANYO等。

1.3方法

1.3.1人参根部组织总RNA的提取及反转录成cDNA的第1条链按照植物总RNA提取试剂盒的提取步骤对人参根组织总RNA进行提取，RNA质量的检测用1%琼脂糖凝胶电泳。以提取的总RNA为模板，以 Oligo-dT 为引物，将RNA反转录合成cDNA，-20 ℃保存。

1.3.2PCR扩增根据GenBank上已报道的人参细胞色素P450 CYP716A53v2基因cDNA（登录号为JX036031）序列设计引物，上游引物为53F：5′-GGGCAAAATCACAGAATTCTTG，下游引物为53R：5′-TTAAAGCGTACAAGGTGATAGACG。以五年生人参根cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系：去离子水7.4 μL，2倍 Power Taq PCR Mastermix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，反转录产物1 μL。反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL扩增产物在1% 琼脂糖凝胶电泳上检测。

1.3.3细胞色素P450 CYP716A53基因的克隆与序列分析PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，放入紫外分析仪内切下目的片段，用凝胶回收试剂盒纯化回收，再将纯化回收目的片段与pMD20-T载体连接成重组质粒pMD20-T/CYP716A53v2，再转化到感受态细胞中进行克隆，涂布在X-gal、IPTG和 Amp 的LB平板上，在气候箱中37 ℃培养14～16 h，随机挑取10个白色菌落，摇菌培养12～14 h，通过质粒提取试剂盒提取质粒和菌落PCR进行快速鉴定，将阳性克隆菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司测序鉴定。将测序获得的序列用DNAMAN 6.0整理翻译成氨基酸，通过ExPasy ProtParam （http：//www.expasy.org/tools/protparam/.html） 分析推测蛋白质的理化性质；采用TMHMM 2.0 进行跨膜结构域预测；利用Blast搜索NCBI上的核苷酸数据库和氨基酸数据库中近缘物种的CYP序列信息，通过MEGA 5.0构建Neighbor-Joining 系统进化树，Bootstrap重复次数为1 000。

2结果与分析

2.1人参总RNA质量检测

本试验采用试剂盒法将提取的人参总RNA经1% 琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1，所提取的总RNA呈现出28S rRNA和18S rRNA等2条条带，条带清晰完整，没有明显降解，说明总RNA 提取成功。

2.2人参细胞色素P450 CYP716A53v2基因PCR结果

以人参根组织cDNA为模板，用细胞色素P450 CYP716A53v2基因的特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测，获得片段大小为1 506 bp（图2）。

2.3细胞色素P450 CYP716A53v2基因的克隆与序列分析

使用载体通用引物对阳性克隆菌液进行菌落PCR检测，获得大小约1 506 bp 片段（图3）。提取的质粒电泳结果显示（图4），质粒分子量较大，说明 pMD20-T载体有外源基因片段插入，为阳性克隆。

对阳性克隆菌液进行测序，并利用 DNAMAN软件进行序列拼接，得到1 506 bp 碱基序列，翻译起始位点位于16 bp，PolyA 位于1 423 bp，开放阅读框长1 410 bp，共编码470个氨基酸，与GenBank上发布的人参细胞色素P450 CYP716A53v2基因的氨基酸（登录号为AFO63031 ）序列完全相符，表明所得重组子是正确的（图5）。

利用ExPasy ProtParam（http：∥www.expasy.org/tools/protparam/.html）在线工具分析人参P450 CYP716A53v2基因编码蛋白的理化性质。推测其蛋白相对分子质量为53.297，分子式为C2 458H3 793N619O665S20，总原子数为7 555。理论等电点为9.12，带正电残基（精氨酸+赖氨酸）为56，带负电残基（天冬氨酸+谷氨酸）为46。该蛋白的不稳定系数为38.57，表明人参P450 CYP716A53v2基因编码的蛋白不稳定。脂肪系数为85.82，亲水性系数为-0.081，表明其为亲水蛋白。利用 TMHMM2.0 进行蛋白跨膜分析，人参P450 CYP716A53v2基因编码的蛋白质没有跨膜区域 （图6）。

人参CYP基因与其他植物CYP基因具有较高的亲源性，分别达到人参（AFO36031）99%、西洋参（AGC31652）98%、三七（AHK23636）98%、西洋参（AED99872）97%、刺五加（AHA50080）84%。人参CYP基因与其他植物相关基因系统发育树见图7。人参CYP基因与五加科植物三七（AHK23636）、人参（AF036031）、西洋参（AGC31652） 、刺五加（AHA50080）以及西洋参（AED99872）亲缘性较高，与植物种属之间的进化相符。

3结论与讨论

人参皂苷的成分及总皂苷的含量是评价人参药材质量的重要指标，三萜皂苷作为人参药材的次生代谢产物，其中，Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1等是主要成分，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、保肝护肝等功效[6-8]，尤其是Rg1对心血管系统、免疫系统、神经系统起到一定的调节作用，还具有抑制细胞凋亡、扩张血管、抗衰老，运动疲劳的恢复等作用[9]。目前，有关人参皂苷积累和形成规律的研究尚不充分，制约了人参药材质量调控机制的研究，已成为进一步提升人参药材质量的制约因素[10]。

人参细胞色素P450 CYP716A53v2催化原人参二醇到原人参三醇，四环三萜皂苷从达玛烷二醇羟基化之后是由CYP（P450）和糖基转移酶的糖基化进行合成的，原人参二醇合成酶（CYP716A47）催化达玛烷二醇C-12位置羟基化，得到原人参二醇，原人参三醇合成酶（CYP716A53v2）催化原人参二醇得到原人参三醇[4]，再经由糖基化得到单体皂苷Rg1。本

试验所克隆的人参细胞色素P450 CYP716A53v2基因与三七、西洋参、刺五加等植物细胞色素CYP（P450）基因序列同源性都很高，它们均属于植物三萜类化合物积累和形成的重要调控限速酶——细胞色素氧化酶家族，同时该试验也验证了种属亲缘关系越近，代谢产物越趋同的观点。笔者认为，可以从人参属其他植物的次级代谢产物中寻找人参皂苷的替代产物。Han等对CYP716A的2个亚族基因（CYP716A52v2和CYP716A53v2）进行了判定，经过过茉莉酸甲酯的处理，重组WAT21酵母的异位表达转接到培养基中培养，体外酶活性测定以及液体色谱和大气压化学电离质谱的确定[4-5]，结果表明，CYP716A53v2基因的产物是原人参二醇6羟化酶，它是达玛烷型三萜苷元在人参皂苷生物合成中的重要步骤，而CYP716A52v2基因的产物是β-香树素C28位羟基化酶，其催化β-香树素生成齐墩果酸，再经由糖基化生成单体皂苷Ro。因此，人参细胞色素P450 CYP716A53v2基因在一定程度上可以决定人参皂苷生物合成的方向，可以在分子水平上用于调节人参皂苷的生物合成，对于进一步提高人参药材质量具有重要指导意义。

通常情况下次生代谢产物是药用植物的主要药效成分，是药材质量的重要标志[11]，即含量及药效成分是药用植物的表现型，表现型是由基因型和环境条件共同作用的[12]。所以，清晰地认识以次生代谢产物为主体的药效成分的形成积累规律及其生态学和分子生物学机制，是实现药材质量控制的重要前提，也是目前药材质量控制技术研究的瓶颈[13-14]。从生态学与分子生物学角度，开展人参皂苷形成与积累规律的研究，阐明其影响主导生态因子和调控机制，对进一步实现人参药材质量调控具有重要指导意义，进而实现人参药材质量“安全、稳定、可控、有效”的目标。

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