周 觅，李青峰，曹 玲，赵 丽，左浩江，裴晓方*

(1．四川大学华西公共卫生学院，四川成都610100; 2．成都市公共卫生临床医疗中心，四川成都610061; 3．成都市妇女儿童中心医院，四川成都610091)

芯片法和培养法对结核分枝杆菌耐药检测的对比研究

周 觅1，2，李青峰1，曹 玲2，赵 丽3，左浩江1，裴晓方1*

(1．四川大学华西公共卫生学院，四川成都610100; 2．成都市公共卫生临床医疗中心，四川成都610061; 3．成都市妇女儿童中心医院，四川成都610091)

选取临床疑似结核病患者聚合酶链反应(PCR)检测阳性标本，分别用芯片法和培养法检测其耐药性以探讨这2种方法对结核分枝杆菌耐药检出率的差异．实验中共选取了228例标本，以异烟肼和利福平为研究对象，利用芯片法和培养法分别统计了样本对这两种药物的耐药性．研究结果表明芯片法和培养法对异烟肼耐药检出率存在统计学差异(P＜0．05)，对利福平耐药检出率没有统计学差异(P＞0．05)．与培养法相比，芯片法有效缩短了对利福平耐药检出率的检测时间，具有快速简便等优点，但对异烟肼耐药检出率存在一定差异．

结核;耐药检出率;芯片法;培养法

结核病是一种经呼吸道传播的慢性传染病，在全球广泛流行．我国结核病疫情属全世界22个高负担国家之一［1－3］．

近年来结核菌耐药已经成为困扰临床影响预后的主要因素．结核耐药按照耐一线药物的不同分为以下4种:单耐药、多耐药、耐多药(MDR－TB)以及广泛耐多药(XDR－TB)．世界卫生组织(WHO)2008年报道显示，全球结核病总耐药率为20．0%．耐药结核病发生大致有以下3点原因:

1)用药方案不合理，包括药物联合的不合理、不恰当、用药剂量不足和服药方法不当以及经济困难或药物不良反应造成间断、不规则用药等;

2)大量结核病患者不能早期被发现，被发现的结核病患者中仍有相当一部分得不到有效的治疗;

3)新的抗结核药物开发和研制的严重滞后也是耐药结核病形成的一个原因，由于耐药结核病不能得到及时治愈，久而久之耐药程度越来越严重，最终也就产生了XDR－TB［4－6］．

利用分子生物技术检测结核分枝杆菌耐药基因，是目前结核病防治领域的一个研究热点．通过聚合酶链反应－单链构象多态性(PCR－SSCP)检测结核菌rpoB基因、katG基因、ahpC基因、pncA基因、rpsL基因和inhA基因突变来研究结核杆菌对抗结核药物的耐药性，取得了很大的成功［7－8］．目前全世界在结核杆菌病及其耐药性的诊断方面尚没有一种快速简便的方法．各医院广泛使用的传统方法主要为培养法加药敏，耗时长花费大且成功率较低，所以临床上急需可以检测致病性结核杆菌病原菌和耐药性有无的快速准确的分析系统．

结核菌耐药的传统检测是进行结核菌培养及药物敏感试验，证实结核菌体外对一种或多种抗结核药物耐药．传统的绝对浓度法和比例法，培养周期较长，需要4～8周才能得到结果，操作复杂，不能完全满足临床需要．随着MTB基因组的破译和耐药分子机制的阐明，建立了许多先进的分子生物学方法［9－14］．研究显示:结核耐药与基因位点突变有关，利福平和异烟肼的3个耐药相关基因分别为rpoB基因、katG基因及inhA基因．华西公共卫生学院自2011年开展了结核分枝杆菌耐药基因检测［15－16］．本文结合工作实际，针对基因芯片法和比例药物敏感试验进行比较，探寻2种方法在检测结核分枝杆菌耐药检出率是否存在差异．

1 实验对象与方法

1．1 菌株 选择2014年6月—2015年3月成都市公共卫生临床医疗中心收治的疑似结核病患者，结核分枝杆菌PCR检测阳性并可做耐药检测标本361例，其中男237例，女124例，男女比例1．91∶1．年龄分布在11岁到85岁．

1．2 仪器与试剂

1．2．1 仪器 生物安全柜Hfsafe－1200型(上海立新仪器公司);CHB－100型恒温金属浴(东莞兴万仪器公司);MR23i高速冷冻离心机(美国Thermo Scientific公司);E－CyclerTM96型晶芯梯度PCR仪(中国博奥生物公司);SlideWasherTM芯片洗干仪;LuxScanTM 10K －B 芯片扫描仪; ABI7500PCR扩增仪(上海艾迪康医学检验所有限公司)．

1．2．2 试剂 分枝杆菌罗氏培养管，由珠海贝索生物技术有限公司提供;耐药基因检测试剂盒(rpoB基因，katG和inhA基因)，核酸提取液，PCR扩增试剂，杂交缓冲液由北京博奥生物科技有限公司提供．

基因芯片清洗缓冲液成分:

1)10%十二烷基硫酸钠(10%SDS)预期用途:用于基因芯片洗涤缓冲液的配制，配制后的洗液用于杂交后芯片的清洗，主要作用为清洗掉芯片上非特异吸附的杂质．主要性能指标260 nm≤0．2，28 nm≤0．2，pH值范围:7．2～7．4，pH值得批间差应符合△pH≤0．4．

2)88．2 g/L柠檬酸钠、175．3 g/L氯化钠(20 *SSC)预期用途:用于基因芯片洗涤缓冲液的配制，配制后的洗液用于杂交后芯片的清洗，主要作用为维持芯片清洗过程中的离子浓度．主要性能指标260 nm≤0．2，28 nm≤0．2，pH值范围:6．9～7．1，pH值批间差应符合△pH≤0．2．

1．3 方法 选取该疑似结核病患者同一时期2份标本，标本类型多为痰液，也可为脑脊液、纤支镜灌洗液、尿液、胸腹腔积液、病理组织等．一份标本进行结核分枝杆菌基因检测．另一份标本进行结核菌培养．

1．3．1 结核分枝杆菌基因及耐药检测 1)TBDNA提取与扩增．向痰液中加入等体积液化液或4%NaOH，振荡混合后37℃30 min以上．取1 mL液化痰于离心管中12 000 r/min，5 min，弃上清液;再加入1 mL洗液(10 mM EDTA或生理盐水)振荡混匀12 000 r/min，5 min，弃上清．向离心管加入50 μL核酸提取液，混匀转入提取管中，核酸提取仪振荡5 min，95℃水浴5 min，5 000 r/min，1 min，将得到的核酸进行第一次扩增．

设置相应的阴性和阳性对照品．扩增程序: 37℃ 5 min 1个循环，94℃ 3 min 1个循环，94℃15 s～60℃ 30 s，40个循环，50℃ 10 s 1个循环，同时选择FAM和HEX(或VIC)通道，荧光采集点选择60℃30 s．选取CT值小于30的阳性标本进行耐药基因检测．每个样本进行3管PCR反应，特异性的扩增耐药基因rpoB及katG、inhA的特异性保守核酸序列．

2)核酸杂交与扫描判读．结核分枝杆菌耐药基因检测(DNA微阵列芯片法)主要分为样品制备、芯片反应和结果判读3步:首先，将结核分枝杆菌的DNA从培养、分离纯化的菌株或直接从临床样品中提取出来;对样品中的靶基因进行扩增和荧光标记，将扩增并荧光标记的基因序列与芯片上的探针进行杂交反应;最后，芯片扫描成像，用配套软件进行判读．具体操作步骤如下:

将PCR扩增产物于PCR仪中95℃变性5 min，立即冰浴3 min;杂交缓冲液50℃热浴10 min，将杂交缓冲液和2个PCR产物按9∶3∶3的比例配制好杂交混合物．将杂交反应盒装配好，吸取15 ul混合物经加样孔加入芯片点阵中，密封杂交盒，放入50℃水浴锅内2 h．预热洗干仪，运行洗涤程序洗涤芯片，甩干，用芯片扫描仪进行结果判读．

3)探针设计．芯片法采用光导原位合成或微量点样等方法，将核酸片段有序地固化于支持物的表面，然后与已经标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量．

实验根据rpoB基因以及katG、inhA基因DNA序列设计了一系列探针．固定了44个探针，其中用于异烟肼耐药检测的有16个探针(其中2个探针检测KatG基因突变位点，1个探针检测inhA基因突变位点)，用于利福平耐药检测的有28个探针．异烟肼耐药基因探针分布如表1所示，利福平耐药基因探针分布如表2所示．

表1 异烟肼相关Kat G基因和inhA基因启动子的探针排布Table 1 The probe arrangement of isoniazid related KatG gene and inhA gene promoter

表2 利福平相关rpoB基因启动子的探针排布Table 2 The probe arrangement of rifampicin related rpoB gene promoter

1．3．2 结核菌培养和比例法药物敏感性试验 参照《结核病诊断实验室检验规程》，留取结核病人痰液于无菌盒，向盛有痰样的无菌盒中加入1～2倍4%NaOH，震荡混匀，15 min后加入pH 6．8磷酸缓冲液混匀，离心后去上清，沉淀再加入0．5～1 mL磷酸缓冲液混匀，严格按照改良罗氏培养法的操作步骤进行处理，将处理好的罗氏培养管于37℃温箱孵育28 d，有菌落生长后参照WHO国际防痨和肺病联合会的标准．使用罗氏药敏培养基，1%比例法测定菌株药物敏感性，各次试验均以H37Rv菌株作为对照．

统计学处理采用SPSS 13．0软件对数据进行统计分析，灵敏度、特异度及准确度采用率的比较，计数资料采用χ2检验，P＜0．05为差异，有统计学意义．

2 结果与讨论

本研究共选取结核分枝杆菌基因扩增阳性病例361例，其中结核菌培养阴性标本63例．结核菌培养阳性，但因为杂菌过多无法进行药敏试验，或者药敏生长不良，无法判断结果的标本70例．对于同一病人同一时期的标本，分别用芯片法和培养法做药敏试验228例．药敏试验异烟肼有0．4 μg/mL、1．6 μg/mL2种浓度，利福平有2 μg/mL、4 μg/mL2种浓度．只要对一种浓度耐药即认为该病人对此药物耐药．利用芯片法和培养法检测结核分枝杆菌对异烟肼的耐药检出率结果如表3所示．

228例样本中，采用两种方法检测结果均表现为耐药的有43例，均表现为敏感的有162例．培养法检测为耐药而芯片法检测为敏感的有17例，芯片法检测为耐药而培养法检测为敏感的有6例．经计算，芯片法对异烟肼的耐药检出率为21．5%，培养法对异烟肼的耐药检出率为26．9%，通过Mc-Nemar检验方法进行计算P=0．035，说明这2种方法对异烟肼耐药检出率有统计学差异．

表3 芯片法和培养法对异烟肼耐药率检出比较Table 3 Comparison of chip method and culture method for the detection of isoniazid resistant rate

表4为芯片法和培养法对利福平耐药检出率数据．228例中，2种方法同时检测出耐药性的有34例，均为敏感的有183例．培养法检测出为耐药而芯片法检测为敏感的有7例，芯片法检测为耐药而培养法检测为敏感的只有4例．经计算芯片法对异烟肼的耐药检出率为16．7%，培养法对该药的耐药检出率18．0%，差异较小．进一步通过McNemar检验方法进行计算P=0．549，表明芯片法和培养法对利福平耐药检出率无统计学差异．

表4 芯片法和培养法对利福平耐药率检出比较Table 4 Comparison of chip method and culture method for the detection of rifampicin resistant rate

3 结论

异烟肼(H)、利福平(R)为一线口服抗结核药物，在临床上广泛应用．传统培养法是用培养阳性的菌株进行药敏试验，大约需要45 d．而芯片法1～2天即可检测结果，极大的缩短了检测时间，具有快速简便的优点．本研究实验数据显示，与临床药敏结果相比较，利福平及异烟肼耐药的芯片检测临床灵敏度(阳性符合率)分别为92．0%和77．4%，临床特异度(阴性符合率)分别为97．2%和96．9%．此次研究也发现芯片法对异烟肼耐药的检测，与培养法存在一定的差异，有一定的局限性，需要做进一步研究探讨．结核分枝杆菌对利福平的耐药率明显低于异烟肼的耐药率．这可能与20世纪80年代中期以前，肺结核病人化疗方案以链霉素、异烟肼的组合为主有关，而20世纪80年代后期特别是90年代以来采用标准化疗方案，故利福平的耐药率，国际和国内的报道均处于较低水平［17－18］．

致谢 成都市卫生和计划生育委员会项目(2015149，项目名称:艾滋合并结核分枝杆菌患者结核耐药状况的研究)对本文给予了资助，谨致谢意．

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Comparison of Chip Method and Culture Method for the Detection of Drug-resistant Mycobacterium Tuberculosis

ZHOU Mi1，2，LI Qingfeng1，CAO Ling2，ZHAO Li3，ZUO Haojiang1，PEI Xiaofang1

(1．West China School of Public Health，Sichuan University，Chengdu 610100，Sichuan; 2．Public Health Clinical Center of Chengdu，Chengdu 610061，Sichuan; 3．Chengdu Women＆Children’s Hospital，Chengdu 610091，Sichuan)

In this paper，the polymerase chain reaction(PCR)positive samples of clinical suspicion of tuberculosis patients in the same period were selected to investigate the difference between chip method and culture method．228 samples were selected in our experiment to research the drug resistance of rifampin and isoniazid．The experimental results indicated that a significantly statistical difference was found in the detection rate of isoniazid resistance when using chip method and culture method(P＜0．05)，but there is no statistical difference in the detection rate of rifampin(P＞0．05)．Compared with culture method，chip method reduced the detection time remarkably showing the high efficiency．However，for the chip method，there were still some differences in detection of isoniazid resistance．

tuberculosis;drug-resistant detection;chip method;culture method

R195．1

A

1001－8395(2016)04－0597－05

10．3969/j．issn．1001－8395．2016．04．026

(编辑 陶志宁)

2015－07－27

四川省卫生和计划生育委员会项目(150036)

*通信作者简介:裴晓方(1964—)，女，教授，主要从事微生物基因结构与功能的研究和应用，E－mail:xxpeiscu@163．com