常艳兵，冯亚娟，何 琼

(曲靖师范学院化学化工学院，云南曲靖655011)

纳米氧化铈和碳纳米管修饰的过氧化氢传感器的研制

常艳兵，冯亚娟，何 琼

(曲靖师范学院化学化工学院，云南曲靖655011)

研制了一种基于碳纳米管(CNT)、纳米CeO2、壳聚糖(CHIT)有机－无机复合膜作为固定基质的酶生物传感器，该复合膜结合了无机碳纳米管、纳米CeO2和有机材料壳聚糖的优点，固定的辣根过氧化酶较好的保持了其生物活性．在优化测试条件下，连续加入相同量的H2O2，该传感器对H2O2的浓度变化产生迅速灵敏的响应，当过氧化氢溶液浓度在3．2×10－6～2．0×10－3mol/L之间变化时，电极对其浓度成线性关系，相关系数为0．978．该生物传感器具有响应速度快、灵敏度高、重现性好等特点，可用于实际样品的检测．

碳纳米管;纳米氧化铈;辣根过氧化酶;过氧化氢;生物传感器

纳米材料因其特异性在催化、生物医药、磁介质和生物电分析领域等方面有着广阔的应用前景［1］，随着纳米技术的不断发展和完善，各种纳米材料广泛应用于电化学生物传感器［2－6］．

目前研究最多的电化学生物传感器是电化学酶传感器．酶的固定化是将酶束缚在特殊的载体上，不仅能使酶和底物之间进行分子交换，又能使酶和整体相互分隔开，保持酶催化特性的方法，该方法具有可反复使用、寿命长的特点［7－9］．目前，酶的固定方法有吸附、共价、交联嵌入法、溶胶－凝胶法［10］、固定含酶的生物组织法、交联酶聚集体、定向固定和共固定技术等．这些固定方法复杂，所用试剂昂贵或溶剂受环境影响比较大，稳定性差、酶易失活．因此，开发和改善电极表面的吸附性能和建立良好的生物相容性，保持酶的活性，对传感器性能的改进具有重要的意义［11］．将低毒、生物相容性好的无机纳米材料掺杂到生物传感器的敏感膜上，为生物材料提供合适的微环境，维持生物组分活性和改善生物传感器性能，从而研制了葡萄糖氧化酶、辣根过氧化酶等一系列的传感器［12－15］．壳聚糖(CHIT)具有无毒性、无刺激性、良好生物相容性、生物可降解性以及生物活性等诸多优良性质而在纺织、印染、制药、食品、生物、环境保护等方面被广泛使用［16－17］．

本实验将碳纳米管和纳米CeO2分散在壳聚糖醋酸溶液中，形成有机－无机杂化膜，吸附辣根过氧化酶后修饰到电极上制成过氧化氢传感器，将其用于样品中过氧化氢的检测，结果令人满意．

1 实验部分

1．1 试剂与仪器 CHI660D电化学工作站(上海辰华仪器有限公司);超声波清洗器(上海科导超声波仪器有限公司);纳米氧化铈、碳纳米管及壳聚糖复合膜修饰的玻碳电极作工作电极．

纳米氧化铈(浙江纳米材料应用工程技术中心);碳纳米管(深圳纳米技术有限公司);磷酸盐缓冲溶液(0．067 mol/L，pH=6．47);辣根过氧化酶(HRP，上海生化试剂公司);H2O2(体积分数为30%的水溶液，上海化学试剂公司);壳聚糖(CHIT，美国Sigma公司);其它化学试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水．

1．2 CNT的处理 取100 mg CNT在350℃下煅烧2 h，除去残余的无定形碳，然后将热处理后的CNT分散在60 mL硝酸(7．0 mol/L)中，不断搅拌，140℃回流12 h，以除去残留的催化剂．离心分离，用去离子水洗涤至上层清液pH值为中性，最后在120℃下干燥2 h，得到纯净的CNT．

1．3 CeO2/CNT/CHIT溶液的制备 称取2．5 mg碳纳米管和25 mg CeO2纳米粉末溶于壳聚糖乙酸溶液中，搅拌1 h，超声波振荡15 min，待碳纳米管和纳米 CeO2粉末均匀分散后得到 CeO2/CNT/ CHIT膜液．

1．4 H2O2传感器的制备

1．4．1 GC/CeO2/CNT/CHIT/HRP电极的制备称取15 mg辣根过氧化酶，用磷酸盐缓冲溶液(pH =6．47)配成0．5 mL溶液．取5 μL此溶液和5 μL CeO2/CNT/CHIT膜液混合均匀后液涂于预处理好的玻碳电极表面，4℃下干燥过夜，使用前用磷酸盐缓冲溶液(0．067 mol/L，pH=6．47)洗涤酶电极，除去未固定在电极表面的酶．

1．4．2 GC/CNT/CHIT/HRP电极的制备 称取2．0 mg CNT溶于4 mL壳聚糖乙酸溶液中，超声波振动15 min，取5 μL此混合液和5 μL HRP酶混匀后涂于预处理好的玻碳电极表面，4℃下干燥过夜待用．

1．4．3 GC/CeO2/CHIT/HRP电极的制备 称取1．0 mg纳米CeO2溶于1 mL壳聚糖乙酸溶液中，超声波振动15 min，取5 μL此混合液和5 μL HRP酶混匀后涂于预处理好的玻碳电极表面，4℃下干燥过夜，电极不用时，置于冰箱中4℃保存．

2 结果与讨论

2．1 循环伏安行为 为了考察辣根过氧化酶的催化作用，比较了GC/CeO2/CNT/CHIT/HRP传感器在不同底液中的循环伏安行为，如图1，其中(a)磷酸盐缓冲溶液(pH=6．47);(b)含有1．0×10－3mol/L对苯二酚的磷酸盐缓冲溶液(pH=6．47); (c)含有1．0×10－3mol/L对苯二酚和过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液(pH=6．47)．可见在磷酸盐缓冲溶液(pH=6．47)中，酶电极产生较低的背景电流:在含有1．0 mmol/L对苯二酚的0．067 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=6．47)中产生一对氧化还原峰，但背景电流信号仍比较低;在1．0 mol/L对苯二酚的0．067 mol/L PBS(pH=6．47)溶液中加入1．0 mmol/L H2O2后氧化峰电流减少还原峰电流明显增大，证实HRP对H2O2具有很好的催化作用．

同时考察了扫描速度对传感器的影响，当扫描速度从20到100 mV/s变化时，传感器在含有1．0 mmol/L H2O2及1．0 mmol/L对苯二酚的缓冲溶液中的循环伏安行为(图2)，从图2中(a)到(e)随着扫描速度的增大峰电流逐渐增大．为了考察电流的特性，将峰电流对扫描速度的平方根作图(见内置图)，从图中可以看出，峰电流与扫描速度的平方根成正比，说明此电流为扩散控制的电流．

2．2 电极的选择 为了考察不同修饰电极对H2O2的催化性能，比较了CeO2/CNT/CHIT/HRP、CeO2/CHIT/HRP和CNT/CHIT/HRP 3种过氧化氢传感器在含有1．0 mmol/L对苯二酚和0．1 mmol/L H2O2的磷酸盐缓冲液(pH=6．47)中的计时电流动态响应见图3，其中(a)纳米氧化铈、碳纳米管和壳聚糖复合膜修饰的辣根过氧化酶电极的计时电流动态响应;(b)纳米氧化铈和壳聚糖复合膜修饰的辣根过氧化酶电极的计时电流动态响应;(c)碳纳米管和壳聚糖复合膜修饰的辣根过氧化酶电极的计时电流动态响应．从图中可以看出3种修饰电极的计时响应电流由高到低依次为 GC/CeO2/CNT/CHIT/HRP、GC/CeO2/CHIT/HRP、GC/CNT/ CHIT/HRP，表明无机纳米粒子CeO2、CNT与有机物CHIT一起对H2O2有协同催化作用．因此，本实验选择GC/CeO2/CNT/CHIT/HRP作为传感器用于检测H2O2．

2．3 测量条件的优化

2．3．1 苯二酚用量对传感器的影响 图4为不同浓度的对苯二酚存在时酶电极的响应电流．从图可看出，电流响应随着对苯二酚浓度的增加而增大，达到饱和后下降．电子媒介浓度较低时，酶－媒介动力机制将限制响应的线性范围，而电子媒介浓度较高时，背景电流又太大，因此在本实验选择使用1．0 mmol/L的对苯二酚．

2．3．2 pH的影响 考察了缓冲液pH值在4．92～8．04范围内对传感器的影响．如图5所示，在pH值为6．47时，响应电流最大，之后随pH值的增大响应电流反而逐渐减小．因此，本实验选择6．47为最佳pH值．

2．3．3 工作电位的影响 在不同工作电位下测定了传感器的响应电流，实验结果表明，电位在350 mV至－40 mV区间，传感器的响应电流平缓增加，但幅度不大;从－40 mV降至－300 mV区间，传感器的响应电流显著增大．为了避免其它物质的干扰，选择拐点－40 mV作为安培测量时的工作电位．

2．4 传感器的性能

2．4．1 传感器的响应性能 在优化实验条件下向底液中连续加入等量H2O2，分别用GC/CeO2/CNT/ CHIT/HRP、GC/CeO2/CHIT/HRP、GC/CNT/CHIT/ HRP修饰电极进行测定，其电流计时曲线如图6，校正曲线见内置图，在含有对苯二酚的硫酸盐缓冲溶液中连续加入20 μL 1．0×10－3mol/L H2O2进行测定，其中(a)纳米氧化铈、碳纳米管和壳聚糖复合膜修饰的辣根过氧化酶电极对H2O2的动态响应;(b)纳米氧化铈和壳聚糖复合膜修饰的辣根过氧化酶电极对H2O2的动态响应;(c)碳纳米管和壳聚糖复合膜修饰的辣根过氧化酶电极对H2O2的动态响应．从图中可以看出，用纳米氧化铈、壳聚糖复合膜修饰的辣根过氧化酶电极和碳纳米管、壳聚糖复合膜修饰的辣根过氧化酶电极对H2O2进行测定，响应电流较弱，且测定H2O2溶液的浓度线性范围较窄，线性较差，相关系数较小．而用纳米氧化铈、碳纳米管和壳聚糖复合膜修饰的辣根过氧化酶电极进行检测时，当H2O2的浓度发生变化，传感器会产生迅速灵敏的响应，说明酶电极有优良的电催化行为．响应电流值随H2O2浓度的增加而增大，当H2O2达到一定浓度时电流也达到饱和，说明此时酶的活性位点被底物饱和．测定H2O2溶液的浓度线性范围是3．2×10－6～2．0×10－3mol/L，回归方程为i=0．783+18．67C，相关系数为0．978．

2．4．2 传感器的重现性 在0．1 mmol/L H2O2溶液中考察了HRP酶电极响应电流的重现性，用同一根过氧化氢传感器连续测定16次，其相对标准偏差为4．67%，说明该传感器具有很好的重现性．

2．4．3 干扰实验 为了考察电极的选择性，在优化实验条件下测定了草酸、酒石酸、抗坏血酸、谷氨酸、葡萄糖等对GC/CeO2/CHIT/CNT/HRP电极的影响，结果见表1．从测定结果可以看出，在相同测定条件下，以上物质对GC/CeO2/CNT/CHIT/HRP电极响应电流都没有明显干扰．

表1 干扰物质对电极的影响Table 1 The effects of interfering substances on electrode

2．5 样品及加标回收检测 为了考察该传感器的实用性，用其测定市售利尔康质量分数为3%的过氧化氢消毒液(温州康林医疗器械有限公司)中H2O2的浓度，并与高锰酸钾氧化还原滴定法测定的浓度对比，结果见表2．实验结果证明利用该传感器和氧化－还原滴定法所测得的结果无明显差异，具有较高的一致性，这表明用该传感器检测H2O2的方法可行．

在优化实验条件下，向市售利尔康质量分数为3%的过氧化氢消毒液(以用该过氧化氢传感器检测其平均浓度1．005 0 mmol/L作为计算相对标准偏差的平均浓度)中加入不同浓度的标准过氧化氢溶液，按实验方法进行检测，加标回收测定结果列于表3．从检测结果可以看出，回收率较好，相对标准偏差较低．

表2 实际样品的测定Table 2 Determination of H2O2in actual sample(n=5)

表3 加标回收的测定结果Table 3 Recovery test of H2O2standards(n=7)

3 结语

本文研制了一种利用CeO2/CNT/CHIT复合膜作为固定基质的新型H2O2传感器，这种有机－无机复合膜结合了两种材料的优势，用该复合膜固定的HRP具有更高的生物活性．将传感器用于检测H2O2，获得了令人满意的结果．该传感器具有响应速度快、灵敏度高、重现性好、制作简单等优点，可用于实际样品的检测．

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Study on the Hydrogen Peroxide Biosensor Modified by Cerium Oxide Nanoparticles and Carbon Nanotube

CHANG Yanbing，FENG Yajuan，HE Qiong

(School of Chemistry and Chemical Engineering，Qujing Normal College，Qujing 655011，Yunnan)

We presented an novel enzyme biosensor based on Carbon nanotube(CNT)，CeO2nanoparticles and chitosan of inorganic-organic complex film as immobilization matrix with good stability．This material combined the advantages of inorganic CNT，CeO2nanoparticles and organic polymer CHIT，and it maintained a good biological activity that fixed horseradish peroxidase．While adding the same amount of H2O2continuously under the condition of optimization test，the sensor produces high sensitive response to H2O2concentration change．When the concentration of hydrogen peroxide solution changes from 3．2×10－6to 2．0×10－3mol/L，there is a linear relation between electrode and its concentration，and the correlation is 0．978．This biosensor has a fast response，a high sensitivity，a good reproducibility．It can be used for the actual sample testing．

carbon nanotube(CNT);Cerium oxide nanoparticles;HRP;hydrogen peroxide;biosensor

O657．15

A

1001－8395(2016)04－0571－05

10．3969/j．issn．1001－8395．2016．04．021

(编辑 周 俊)

2015－05－29

云南省教育厅科学研究基金(2013Y014)和云南省大学生创新创业训练计划(201310684002)

常艳兵(1980—)，男，副教授，主要从事电分析化学及生物传感器方面的研究，E－mail:chang－yanbing@126．com