牛　蓓， 郭晓恒， 严铸云， 宋登敏， 刘　涛

(1．成都大学 医学院， 四川 成都　610106； 2．成都中医药大学 药学院， 四川 成都　611131)



16批不同来源僵蚕白僵菌素含量测定及微量元素分析

牛蓓1， 郭晓恒1， 严铸云2， 宋登敏1， 刘涛1

(1．成都大学 医学院， 四川 成都610106； 2．成都中医药大学 药学院， 四川 成都611131)

摘要：目的：对16批不同来源僵蚕进行白僵菌素含量测定及微量元素分析.方法：采用HPLC法测定白僵菌素的含量，色谱柱为Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈—水—四氢呋喃(5.5∶3.5∶1)梯度洗脱；检测波长为215 nm，流速1 mL·min-1，柱温为常温.用原子光谱吸收法对药材中的Mg、Ca、Fe、Zn、Cu、Mn、Cr、Ni、Pb、Cd 10种元素进行测定.结果：白僵菌素含量在线性范围线性关系良好(r=0.9999)，加样回收率为99.19%，不同来源僵蚕的蚕白僵菌素含量差异较大.微量元素测定发现，僵蚕中镁、铅的含量较高.结论：16批不同来源僵蚕白僵菌素质量差别较大，无明显地域特征.但条肥壮，断面充实，明亮，质硬的僵蚕及其炮制品，白僵菌素的含量普遍较高，质量较好，与传统经验鉴别一致.

关键词：僵蚕；白僵菌素;高效液相色谱法；原子光谱吸收法

0引言

僵蚕，又称白僵蚕、天虫、姜蚕，主治祛风定惊，化痰散结，临床多用于治疗惊风抽搐，咽喉肿痛、皮肤瘙痒、颌下淋巴结炎、面神经麻痹等症.研究表明，其具有抗凝、抗血栓、促进微循环、抗癌、降糖、增加免疫、镇静催眠等功效[1-2].僵蚕是以白僵菌对蚕娥科昆虫家蚕的幼虫感染或人工接种致死后的干燥体，主产区为四川、山东、浙江、江苏、广东，其中四川产药材为主流品种[3-7]，其药效成分不明确，质量标准不完善[1].白僵菌素是由僵蚕中提取得到的一种环状三羧酸钛，与僵蚕的抗惊厥、镇静的药理作用有关[8-9]，但未见其含量调查的相关报道.为此，本研究对不同来源的僵蚕，按传统经验鉴别进行分类后，分别测定了其中白僵菌素的含量和微量元素含量，补充完善了僵蚕的物质学基础研究.

1材料与方法

1.1药材和试剂

实验所用16个批次不同来源药材经成都中医药大学严铸云教授鉴定为僵蚕，白僵菌素为本实验室分离所得.

实验所用试剂包括:乙腈为色谱纯，三氯甲烷、甲醇、硝酸、高氯酸等试剂均为分析纯，水为超纯水(Ω>18 M)；Cu、Mg、Zn等标准溶液(%SBG2069-90，1000 μg·mL-1)由国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院提供，稀释至所需浓度后使用.

1.2实验仪器

实验所用仪器包括：530G型分光光度计(安捷伦科技上海仪器有限公司)；SHIMADZU型高效液相色谱仪，LC-10A型泵，SPD-10A型检测器，N2000型色谱工作站，KQ50型超声波清洗器，十八烷基硅烷键合硅胶柱Diamonsil C18(5 μ，250×4.6 mm)，迪马公司(柱号：8037434)，AA-7700型原子吸收光谱仪(北京东西电子技术研究所)，Mg、Ca、Fe、Zn、Cu、Mn、Cr、Ni、Pb、Cd等10种元素空心阴极灯，烘箱，电子分析天平，电动碾磨机等.

1.3实验方法

1.3.1 对照品溶液制备.

精密称取经硅胶干燥器干燥数月的白僵菌素样品适量，加甲醇制成20.8 μg/mL的对照品溶液.

1.3.2供试品溶液制备.

精密称取16个批次的僵蚕粗粉各2.0 g，加入90%甲醇20 mL，称定，加热回流90 min，取出， 放置至室温再称定，用90%甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液10 mL，蒸干，再以甲醇定容至10 mL，离心，过滤，取续滤液作为供试品溶液.

1.3.3色谱条件色谱柱.

实验色谱条件为：色谱柱为Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈—水—四氢呋喃(5.5∶3.5∶1)梯度洗脱；检测波长为215 nm，流速 1 mL/min，柱温为常温，进样量10 μL.

1.3.4方法学评价.

1)线性关系考察.分别精密吸取白僵菌素对照溶液20.8 μg/mL手动进样4、8、12、16、20 μL，测定白僵菌素峰面积积分值.以白僵菌素的进样量为横坐标，其峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线.

2)精密度试验.取“1.3.1”项下对照品溶液20.8 μg/mL，按“1.3.3”项下方法连续进样5次，记录色谱峰面积，通过计算RSD以考察仪器的精密度.

3)稳定性试验.精密吸取同一供试品溶液5 μL，分别于0、4、8、12、24 h进样，测定白僵菌素峰面积，通过计算RSD以考察本样品的稳定性.

4)重复性试验.取同一批样品5份，精密称定，依“1.3.2”项下方法平行制备5份供试液，分别精密吸取供试品溶液5 μL注入液相色谱仪，按“1.3.3”项下方法下色谱条件进行分析，记录色谱峰面积，通过计算RSD考察本方法的重复性.

5)加样回收率试验.精密称取已知含量的僵蚕药材5份，分别精密添加“1.3.1”项下各白僵菌素对照品贮备溶液适量0.416 mg，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“1.3.3”项下色谱条件下进样，计算各成分的加样回收率和RSD，并进行统计.

1.3.5白僵菌素含量测定.

按“1.3.2”项下方法制备16批供试品溶液，平行3份，按“1.3.3”项下方法进行测定，测定白僵菌素的含量.

1.3.6微量元素测定.

本研究选择采用硝酸+高氯酸的混合酸体系(4∶1)作为消化液.对4种类型的僵蚕(具体见表2)进行处理.消化过程中通过控制温度使溶液保持微沸状态，既可以使样品消化完全，又能避免温度过高使溶液碳化.样品用AA-7700型原子吸收光谱仪进行分析[10]，实验数据采用Heml进行聚类分析相似性分析.

2结果与讨论

2.1含量测定条件选择

2.1.1供试品溶液制备方法选择

实验中，分别考察了甲醇、90%甲醇、无水乙醇3种试剂对白僵菌素提取效果的影响，结果以90%甲醇提取效果较好；分别考察了超声提取、加热回流提取60 min、索氏提取3种提取方法对白僵菌素提取效果的影响，以加热回流提取60 min效果较好；分别考察了加热回流30 min、45 min、60 min、90 min、120 min，结果在90 min时提取完全，白僵菌素含量最高.

2.1.2检测波长的确定与流动相选择.

1)检测波长的选择.取白僵菌素对照品溶液，在波长200～400 nm 范围内进行DAD全波长扫描，在波长215 nm处有最大吸收，因此选择215 nm作为检测波长.

2)流动相的选择.比较了乙腈—水、甲醇—水、甲醇—水—磷酸、乙腈—甲醇—四氢呋喃、乙腈—水—四氢呋喃及其不同比例，结果显示，乙腈—水—四氢呋喃分离度较好，选为流动相.

3)流动相流速的考察：分别考察了1 mL/min、0.8 mL/min、0.6 mL/min 3种流速，结果显示，1 mL/min时分离度较好，出峰时间合适.

2.2色谱柱分离情况

按照“1.3.3”项色谱条件进行分析，各成分分离度良好，以外标法计算含量，理论板数按刺五加苷E峰计算，不得低于3 000.在上述色谱条件下，对照品与样品色谱情况见图1.

图1　色谱柱分离情况

2.3HPLC分析方法评价

2.3.1方法的回归方程和线性关系.

分别按“1.3.4”项下“1)”方法进行测定，经回归处理，计算得回归方程，y=1915103.44x+4262.0566,r=0.9999.说明白僵菌素进样量在0.083～0.416 μg范围内与峰面积积分值呈较好的线性关系.

2.3.2精密度实验.

按“1.3.4”项下“2)”方法进行测定，RSD为0.8994%，表明仪器精密度良好.

2.3.3稳定性试验.

按“1.3.4”项下“3)”方法进行测定，RSD为2.17%，供试品溶液在0～24 h内稳定性较好.

2.3.4重复性试验.

按“1.3.4”项下“4)”方法进行测定，测定白僵菌素含量白僵菌素含量RSD<3%，说明本方法的重复性良好.

2.3.5加样回收率试验.

按“1.3.4”项下“5)”方法进行测定，结果白僵菌素的平均回收率为99.19%，RSD为1.40%(具体见表1)，说明本方法较准确.

2.4不同来源地僵蚕中白僵菌素含量测定

精密称取不同来源的样品2 g，按“1.3.2”项下方法制备供试液，按“1.3.5”项下方法测定.结果见表1.对同一样品进行测定，测得白僵菌素含量，根据标准曲线计算含量，其RSD为2.80%.

以白僵菌素为指标成分对不同来源的僵蚕进行检测，结果显示不同来源的僵蚕未炮制品和炮制品白僵菌素含量不一.将不同来源的僵蚕按药材特征[6-7]分为4组(见表1).实验数据显示，不同来源地的僵蚕的白僵菌素含量有较大的差异.平均含量高低依次为：第4组0.4320 mg/g、第3组为0.3978 mg/g、第1组为0.2775 mg/g、第2组为0.1772 mg/g.可见，此次采集的僵蚕所得白僵素含量与炮制与否无明显相关性，传统经验鉴别质量较好的僵蚕(条肥壮，断面充实，明亮，质硬的僵蚕及其炮制品)，白僵菌素的含量相对较高.

2.5僵蚕中微量元素测定

石墨炉—原子吸收光谱法常用于测定重金属含量，其稳定性和准确性较好[10]，在丹参、白术等药材中都有应用[10-11].本研究将此法用于测定僵蚕的微量元素，实验结果表明僵蚕富含多种微量元素，且含量较高(见表2).《中国药典》2015版规定重金属含量标准为Pb元素<5.0 ppm，Cd元素<0.2 ppm.数据表明， 如何控制僵蚕中的重金属含量有待深入研究.通过聚类分析相似性分析，结果显示微量元素中除了Mg元素外，其余元素含量在4组中无明显差异，但炮制品比未炮制品僵蚕中的Mg元素的含量有所下降(见图2).

表116不同来源僵蚕样品白僵菌素含量测定(n=3)

表2　所测僵蚕中微量元素含量(mg/g)

注：分组情况与表1相同.

图2　所测僵蚕中微量元素聚类相似性分析

3结论

本研究以白僵菌素为研究对象，对不同来源的16个批次的僵蚕进行了含量测定.结果表明：僵蚕中白僵菌素的含量差别较大(0.0316～0.6259 mg/g)；条肥壮，断面充实，明亮，质硬的僵蚕中，白僵菌素的含量普遍较高，与传统的经验鉴别一致，而与炮制与否无明显相关性，此表明可将白僵菌素作为僵蚕质量评价的一个待选指标.目前，重金属含量超标为中药应用的制约因素，16个批次的僵蚕样品中Pb元素的含量较高，如何控制僵蚕中的重金属含量有待深入研究.本研究利用传统经验鉴别、白僵菌素测定与重金属含量检测，分别对不同来源的16个批次的僵蚕样品进行评价，为僵蚕的质量评价指标选择提供参考.

参考文献：

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Content Determination and Trace Elements Analysis of Bombyx Batryticatu Beauvericin from 16 Different Sources

NIUBei1,GUOXiaoheng1，YANZhuyun2，SONGDengmin1，LIUTao1

(1.school of Medicine ,Chengdu University， Chengdu 610106， China;2.School of Chinese Pharmacy,Chengdu University of TCM, Chengdu 611131， China)

Abstract:The paper is going to determine the content and analyze the trace elements of bombyx batryticatu beauvericin from 16 different sources.The HPLC methods are used for the content determination of beauvericin from bombyx batryticatu.Diamonsil C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm) is adopted for gradient elute with the mobile phase consisting of acetonitrile-water-tetrahydrofuran (5.5∶3.5∶1). The detection wavelength is set at 215 nm.The flow rate is 1.0 mL/min.The column temperature is room temperature.The determination of trace elements (Mg,Ca,Fe,Zn,Cu,Mn,Cr,Ni,Pb,Cd) is done by Atomic Absorption Spectrometry.The results show that the content of beauvericin from bombyx batryticatu in linear range generates good linear relation (r=0.9999) and good recovery rate(99.19%).The content of beauvericin from different bombyx batryticatu varies a lot.The trace elements determination shows that the content of Pb and Mg is higher in bombyx batryticatu.The conclusion drawn in the paper is that the quality of beauvericin from 16 different sources differs a lot,and no obvious regional features are shown.But bombyx batryticatu and its processed products with whole material fullness,bright and hard sections have generally higher content of beauvericin of better quality,which is consistent with the traditional identification by experience.

Key words:Bombyx batryticatu;beauvericin;HPLC;atomic absorption spectrometry

文章编号：1004-5422(2016)02-0120-04

收稿日期：2016-04-28.

基金项目：四川省中医药管理局重点课题(2003A07)资助项目.

作者简介：牛蓓(1974 — )， 女， 博士， 讲师， 从事生物化学与分子生物学研究.

中图分类号：R917；R927.2

文献标志码：A