王立新　　王元松　　田风胜　　崔荣岗　　边　云　　苏　阳　　迟秀娥

河北医科大学附属沧州中西医结合临床医学院内分泌科，河北沧州　061001

复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠坐骨神经Bax 及Bcl-2表达的影响

王立新王元松田风胜▲崔荣岗边云苏阳迟秀娥

河北医科大学附属沧州中西医结合临床医学院内分泌科，河北沧州061001

目的探讨复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠坐骨神经Bax及Bc1-2表达的影响。方法将60只大鼠分为正常组（10只）和造模组（50只）。造模组大鼠制备糖尿病模型后随机抽取40只，将其分为糖尿病组（10只）、复荣通脉低剂量组（10只）、复荣通脉中剂量组（10只）和复荣通脉高剂量组（10只），分别给予0.7、1.4、2.8 g/kg复荣通脉灌胃，正常组和糖尿病组给予等量纯净水灌胃。灌胃8周后，留取大鼠坐骨神经制备病理切片，SP法兔疫组化染色，观察各组Bax及Bc1-2表达情况。结果与正常组比较，糖尿病组及复荣通脉低、中、高剂量组Bax表达明显升高，Bc1-2表达明显下降（P＜0.05）；复荣通脉低剂量组Bax及Bc1-2表达与糖尿病组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；复荣通脉中、高剂量组Bax表达明显降低，Bc1-2表达明显升高（P＜0.05）；与复荣通脉低剂量组比较，复荣通脉中、高剂量组Bax表达明显降低，Bc1-2表达明显升高（P＜0.05）；复荣通脉高剂量组Bax及Bc1表达与复荣通脉中剂量组比较，差异均无统计学意义 （P＞0.05）。结论复荣通脉胶囊可抑制糖尿病大鼠坐骨神经Bax的表达和Bc1-2表达下降，具有抑制糖尿病大鼠坐骨神经细胞凋亡的作用。

复荣通脉胶囊；糖尿病；坐骨神经；Bax；Bcl-2

［Abstract］Objective To exp1ore the the inf1uence of FuRongTongMai Capsu1es on sciatic nerve expression of Bax and Bc1-2 in rats with diabetes me11itus（DM）.Methods 60 rats were random1y divided into two groups∶norma1 contro1 group（NC，n=10），bui1d mod1e group（n=50）.After the diabetes me11itus（DM）rats were made，40 of diabetes rats were random1y divided into DM group（n=10），FuRongTongMai 1ow dosage group（FRL）（n=10），FuRongTongMai midd1e dosage group（FRM）（n=10），FuRongTongMai high dosage group（FRH）（n=10），and they were given the 1.4，0.7，2.8 g/kg FuRongTongMai Capsu1es by gavage respective1y，and rats of the contro1 group and DM group were given the same dose of purified water dai1y.8 weeks after 1avage，sciatic nerve was took down for patho1ogy s1ice，the expression of Bax and Bc1-2 was observed after SP immunohistochemistry staining.Results Compared with NC group，sciatic nerve expression of Bax in the DM group，FRL group，FRM group，and FRH group was significant1y increased and Bc1-2 was significant1y decreased（P＜0.05）；compared with DM group，expression of Bax and Bc1-2 in the FRL group had no significant1y（P＞0.05），expression of Bax in the FRM group and FRH group was significant1y decreased and Bc1-2 was significant1y increased（P＜0.05）；compared with FRL group，expression of Bax in the FRM group and FRH group was significant1y decreased and Bc1-2 was significant1y increased（P＜0.05）；compared with the FRM group，expression of Bax and Bc1-2 in the FRH group had no significant1y（P＞0.05）.Conclusion FuRongTongMai Capsu1es can inhibit the expression of Bax and the decreasing of Bc1-2 in sciatic nerve of diabetes rats，have the function of inhibit sciatic nerve apoptosis in diabetes rats.

［Key words］FuRongTongMai Capsu1es；Diabetes；Sciatic nerve；Bax；Bc1-2

糖尿病周围神经病变（diabetic periphera1 neuropathy，DPN）是糖尿病常见慢性并发症之一，2型糖尿病患者糖尿病周围神经病变的发病率为61.8%，总发病率为60.3%［1］，高血糖是导致周围神经病变的主要原因。对其治疗主要是营养神经、改善微循环及抗氧化应激等治疗，近些年来中医药治疗糖尿病周围神经病变取得了显著的疗效。我们前期研究表明，复荣通脉胶囊（冀药制字：Z20070041）可增加糖尿病大鼠坐骨神经中神经生长因子表达水平，增强受损神经纤维的修复再生能力［2］，但其作用机制尚未完全阐明。本课题旨在通过探讨复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠坐骨神经B细胞淋巴瘤基因-2（Bc1-2）及Bax表达的影响，探讨其可能的药效学机制，为复荣通脉胶囊治疗糖尿病周围神经病变提供理论基础和实验依据。现将研究结果报道如下：

1　对象与方法

1.1对象

8周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠60只，体重为（200±30）g，由河北医科大学实验动物中心提供［动物合格证号：1405034，单位许可证号：SCXK（冀）2013-1-003］。每笼4只，自由饮水，室温22～26℃。湿度45%～65%，每日12 h光照维持，昼夜循环。链脲佐菌素（STZ）、柠檬酸钠：美国Sigma公司；Bax及Bc1-2兔疫组化试剂盒：石家庄市淼森科技有限公司；德国罗氏血糖仪（罗康全活力型）；日本日立7600-010全自动生化分析仪；日本奥林巴斯BX51T-PHD-J11光学显微镜及其照相装置；病理组织漂烘处理仪；日本HM-200电子天平；德国Eppendorf-5430离心机；德国莱卡RM2015石蜡切片机；日本三洋MDF-382E型超低温冰箱；江苏太仓医用仪器厂DSHZ-300型恒温水浴箱；美国Media Cybernetics公司多功能真彩色细胞图象分析管理。复荣通脉胶囊主要组成：水蛭、地龙、全蝎、黄芪、当归、玄参、葛根、穿山龙、首乌藤、川牛膝、甘草，由河北省沧州中西医结合医院中药制剂室监制生产，由多种中药粉末组成，每粒0.5 g，含生药2 g，按比例加入水制成混悬液。批准文号：冀药制字Z20070041，生产批号：140310。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立8周龄雄性健康Wistar大鼠60只，体重均在200 g左右，适应性喂养1周后，按照完全随机原则对其进行分组，正常组10只，造模组50只。造模组大鼠禁食12 h后按文献［3-4］方法略作改进，一次性腹腔注射1%STZ 60 mg/kg临用前配制（STZ临用前配制，溶于0.1 mmo1/L、pH=4.2的无菌柠檬酸缓冲液），正常组腹腔注射等量的柠檬酸钠缓冲液。72 h后尾静脉取血，测血糖≥16.7 mmo1/L，即为造模成功，确定为糖尿病大鼠。平稳1周后列入观察对象。造模过程顺利，造模结束后其中3只血糖值未达诊断标准弃去不用，3只死亡，共造模成功44只。

1.2.2分组与给药 成模后，随机抽取40只分为糖尿病组（10只）、复荣通脉低剂量组（10只）、复荣通脉中剂量组（10只）、复荣通脉高剂量组（10只）。成模后1周，参考文献［5］方法，中药治疗组剂量按人体-大鼠体表面积比值表换算出大鼠的等效剂量，复荣通脉中剂量组给予1.4 g/kg灌胃，复荣通脉低剂量组给予0.7 g/kg灌胃，复荣通脉高剂量组给予2.8 g/kg灌胃，正常组和糖尿病组每日给予同等剂量纯净水灌胃。大鼠每日灌胃1次，灌胃容量10 mL/kg，连续8周。实验期间大鼠自由进食水，予标准大鼠饲料，每天更换垫料，清理实验室，每天重新配制灌胃药物。实验期间均未使用胰岛素和其他降糖药。

1.2.3标本的处理 连续灌胃8周后，各实验组大鼠隔夜禁食12 h，饮水不限。空腹称重，以3%戊巴比妥（80 mg/kg）腹腔注射麻醉，尾尖测血糖后，迅速分离腹主动脉，从腹主动脉采血测胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）。

1.2.4石蜡切片与免疫组化测定 留取1～2 cm坐骨神经置于4%多聚甲醛进行固定，洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，片厚约5 μm，SP法兔疫组化染色，采用彩色病理图文分析系统计算病理切片组织中白细胞介素-1（IL-1）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）阳性染色面积与视窗面积的百分比。

1.3统计学方法

采用SPSS 11.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；对各项指标进行正态性检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差不齐时应用多个独立样本比较的SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1血糖变化

与正常组比较，灌胃前糖尿病组及复荣通脉低、中、高剂量组血糖明显升高（P＜0.05）；糖尿病组及复荣通脉低、中、高剂量组组间血糖比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常组比较，灌胃后糖尿病组及复荣通脉低、中、高剂量组血糖明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；糖尿病组及复荣通脉低、中、高剂量组组间血糖比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠灌胃前后血糖水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1　各组小鼠血糖变化情况（mmo1/L，±s）

表1　各组小鼠血糖变化情况（mmo1/L，±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；造模前血糖经检验呈非正态分布，故采用SNK-q检验

组别　　例数　造模前　　成模后灌胃前　　灌胃后正常组糖尿病组复荣通脉低剂量组复荣通脉中剂量组复荣通脉高剂量组10 9 10 99 4.42±0.37 4.72±4.41 4.66±0.80 4.27±0.39 4.31±0.66 4.98±0.26 29.43±4.41*28.38±1.60*29.74±0.69*29.59±1.05*4.86±0.20 26.68±4.55*28.20±1.26*28.34±1.58*29.17±0.96*

2.2 TC及TG表达

灌胃8周后，与正常组比较，糖尿病组及复荣通脉低、中、高剂量组胆固醇明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；糖尿病组胆固醇与复荣通脉低、中、高剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。灌胃8周后，与正常组比较，糖尿病组及复荣通脉低、中、高剂量组TG明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；糖尿病组及复荣通脉低、中、高剂量组组间TG比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2　各组大鼠血脂变化情况（mmo1/L，±s）

表2　各组大鼠血脂变化情况（mmo1/L，±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；TC：总胆固醇；TG：三酰甘油；TC数据经检验呈非正态分布，故采用SNK-q检验

组别　　例数　TC（mmo1/L）　TG（mmo1/L）正常组糖尿病组复荣通脉低剂量组复荣通脉中剂量组复荣通脉高剂量组10 9 10 99 1.52±0.08 1.78±0.22*1.74±0.15*1.72±0.16*1.71±0.15*0.66±0.19 1.14±0.50*1.48±0.24*1.40±0.15*1.40±0.73*

2.3坐骨神经Bax及Bcl-2表达

与正常组比较，糖尿病组及复荣通脉低、中、高剂量组Bax表达明显升高，Bc1-2表达明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）；复荣通脉低剂量组Bax及Bc1-2表达，与糖尿病组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；复荣通脉中、高剂量组Bax表达明显降低，Bc1-2表达明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与复荣通脉低剂量组比较，复荣通脉中、高剂量组Bax表达明显降低，Bc1-2表达明显升高（P＜0.05）；复荣通脉高剂量组Bax及Bc1表达与复荣通脉中剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1～2（封三）、表3。

表3　各组大鼠Bax及Bcl-2变化情况（%，±s）

表3　各组大鼠Bax及Bcl-2变化情况（%，±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与糖尿病组比较，#P＜0.05；与复荣通脉低剂量组比较，▲P＜0.05

组别　　例数　Bax　Bc1-2正常组糖尿病组复荣通脉低剂量组复荣通脉中剂量组复荣通脉高剂量组10 9 10 99 0.13±0.05 1.21±0.19*0.78±0.15*0.41±0.15*#▲0.39±0.18*#▲1.20±0.11 0.08±0.02*0.31±0.17*0.46±0.12*#▲0.48±0.10*#▲

3　讨论

糖尿病周围神经病变的病因及发病机制目前尚未完全阐释清楚，有研究表明，高血糖可诱发糖尿病大鼠颈上神经节细胞的凋亡，激活Caspase-3，而诱导神经元细胞的凋亡［6-7］。细胞凋亡在糖尿病周围神经病变的发生发展中发挥重要的作用，神经细胞凋亡增多是糖尿病周围神经病变的主要病理表现之一［8-11］，糖尿病大鼠背根神经节细胞凋亡的增加是糖尿病周围神经病变的致病因素［12］，细胞凋亡的发生是在多种凋亡相关基因的调控下进行的。

Bax和Bc1-2与凋亡密切相关［13-14］，同属Bc1-2基因家族成员，二者之间的比例决定了细胞是凋亡还是存活［15-17］。Bc1-2过度表达可以抑制多种因素如射线、抗癌药物、去除IL-3等诱导细胞凋亡［18］。Bax的过度表达可促进细胞凋亡，保护正常细胞不发生恶变。Bc1-2通过与Bax结合形成异二聚体发挥抗细胞凋亡的作用［19］。有研究表明，糖尿病大鼠随病程的延长，糖尿病大鼠背根神经节神经元凋亡率逐渐上升，且Caspase-3蛋白表达和糖尿病大鼠背根神经节神经元凋亡与DNA氧化损伤存在明显相关性，支持氧化损伤导致细胞凋亡［8，20］。

祖国医学认为“血瘀”贯穿了糖尿病慢性并发症的始终，而糖尿病周围神经病变的主要病机是气阴两虚，瘀血阻络。有研究表明，活血化瘀中药能改善糖尿病大鼠血液流变性、降低血小板聚集、改善血流、增加周围神经的供血和营养、抑制坐骨神经的纤维脱髓鞘和轴索萎缩、提高传导速度［21］，益气活血通络方药能抑制坐骨神经细胞凋亡，并对其调控基因有一定的调节作用［11］。

本研究发现，糖尿病大鼠坐骨神经促凋亡基因Bax的表达明显上调，抑凋亡基因Bc1-2的下降，它们在糖尿病周围神经病变的发生发展过程中起重要作用。复荣通脉中、高剂量组能够明显抑制Bax的表达增加，并能抑制Bc1-2表达的下降，但复荣通脉低剂量组无此种效果；并且复荣通脉中、高剂量组之间差异无统计学意义。表明复荣通脉胶囊的作用呈剂量依赖性，但非线性关系，从药物经济学的角度考虑中等剂量复荣通脉胶囊为最佳剂量。复荣通脉胶囊对血糖、血脂没有影响，故而其对糖尿病血管病变的保护作用是非降糖、降脂依赖的。

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Influence of FuRongTongMai Capsules on sciatic nerve expression of Bax and Bcl-2 in rats with diabetes mellitus

WANG LixinWANG YuansongTIAN Fengsheng▲CUI RonggangBian YunSU YangCHI Xiu'e
Department of Endocrino1ogy，Affi1iated Cangzhou Traditiona1 Western Combination Medica1 C1inica1 Medica1 Schoo1 of Hebei Medica1 University，Hebei Province，Cangzhou061001，China

R285.5

A

1673-7210（2016）04（c）-0024-04

河北省沧州市科学技术研究与发展指导计划项目（141302131）。

2016-01-18本文编辑：任 念）