王　发，王荪璇，刘雪峰，韩喆青

(陕西省食品药品检验所，陕西 西安　710061)



变波长高效液相色谱法测定布洛芬混悬液中6种防腐剂的含量

王发，王荪璇，刘雪峰，韩喆青

(陕西省食品药品检验所，陕西 西安710061)

摘要：目的建立布洛芬混悬液中6种常用防腐剂的分离测定方法。方法Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇-0.02 mol·L-1乙酸铵溶液，梯度洗脱，流速：1.0 mL·min-1，柱温：30 ℃，检测波长：变波长。用保留时间定性，以峰面积按标准曲线法定量。结果6种防腐剂分离良好，在0.002～0.05 g·L-1的质量浓度范围内线性关系良好(r≥0.999)，平均加样回收率97.2%～100.6%， RSD≤2.2%。结论该法简单、准确，可用于布洛芬混悬液中防腐剂的定性和定量检测。

关键词：防腐剂,药物/分析；色谱法,高压液相；布洛芬；悬液

布洛芬属苯丙酸类非甾体抗炎药,具有解热,镇痛,抗炎作用。布洛芬混悬液临床上主要应用于儿童普通感冒或流行性感冒引起的发烧，也用于缓解儿童轻至中度疼痛，如头痛、关节痛、牙痛、神经痛等[1-2]。口服液体制剂通常选用苯甲酸类和羟苯酯类作为防腐剂。防腐剂作为药物制剂中的一个重要组分，大多数情况下是安全的。但是，近年来大量的临床观察和实验资料表明，这些化学物质本身存在着一定的刺激性和毒性，被人体吸收后会产生副作用，危害人们的身体健康。目前食品安全国家标准GB2760-2014对食品中可用的防腐剂的种类和限度进行了规定[3]，而药品中防腐剂种类和限度还未见明确规定，因此制定药品中防腐剂的含量测定方法，在保障临床用药的安全性方面具有重要意义。目前国内布洛芬混悬液生产企业众多，所加防腐剂的种类与浓度亦各不相同，已有文献报道[4]的方法仅限于苯甲酸的测定，不适用于多品种多批次的快速筛查。通过查阅相关企业的药品说明书与文献资料[6-8]，本文建立了6种常见防腐剂的分离测定方法，并采用此方法对国内7家不同企业的22批产品进行了测定。

1仪器与试药

1.1仪器沃特世2695高效液相色谱仪，沃特世2489紫外检测器，梅特勒AE-240型电子分析天平，同泰联TTL-101型实验室专用超纯水系统。

1.2试剂和样品苯甲酸标准品(中国食品药品检定研究院提供，批号：100419-200301)、山梨酸标准品(中国食品药品检定研究院提供，批号：205-9401)、羟苯甲酯标准品(中国食品药品检定研究院提供，批号：100278-201103，99.6%)、羟苯乙酯标准品(中国食品药品检定研究院提供，批号：100847-201102，99.9%)、羟苯丙酯标准品(中国食品药品检定研究院提供，批号：110009-200503，99.4%)、羟苯丁酯标准品(中国食品药品检定研究院提供，批号：110792-200503)，甲醇为色谱纯，水为高纯水，乙酸铵为分析纯；布洛芬混悬液分别由A公司(批号：20150501)，B公司(批号：150102)，C公司(批号：50214063、50215021、50215055、50315002、50315013、50315022、50315026)，D公司(批号：140833、14094、141104、150518、150523、150533)，E公司(批号：141201)，F公司(批号：20150317-2、20150527-2、20150606-1)，G公司(批号：C141216、C150112、C150308)等7家企业提供，共22批。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：以甲醇为流动相A，0.02 mol·L-1乙酸铵溶液为流动相B；梯度洗脱，0～6 min，30%～30% A，6～15 min，30%～70% A，15～22 min，70%～70% A，22～25 min，70%～30% A，25～30 min，30%～30% A；变波长检测模式：0～5.5 min，检测波长为230 nm，5.5～30.0 min，检测波长为254 nm；柱温：30 ℃，流速:1.0 mL·min-1,进样体积:10 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1供试品溶液的制备用内容量移液管精密量取供试品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，用10%甲醇溶液30 mL洗出吸管内壁的附着液，洗液并入量瓶中，充分振摇使溶解，加10%甲醇溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得供试品溶液。

2.2.2对照品储备溶液的制备精密称定苯甲酸标准品10.51 mg、山梨酸标准品10.80 mg、羟苯甲酯标准品11.16 mg(实际含羟苯甲酯为11.12 mg)、羟苯乙酯标准品10.53 mg(实际含羟苯乙酯为10.52 mg)、羟苯丙酯标准品10.28 mg(实际含羟苯丙酯为10.22mg)、羟苯丁酯标准品11.35 mg，置100 mL量瓶中，用10%甲醇溶液溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品储备液。

2.3线性关系分别精密量取对照品储备溶液适量，用10%甲醇溶液稀释成含苯甲酸依次为0.002 102、0.005 255、0.010 51、0.021 02、0.052 55 g·L-1，山梨酸依次为0.002 160、0.005 400、0.010 80、0.021 60、0.054 00 g·L-1，羟苯甲酯依次为0.002 224、0.005 560、0.011 12、0.022 24、0.055 60 g·L-1，羟苯乙酯依次为0.002 104、0.005 260、0.010 52、0.021 04、0.052 60 g·L-1，羟苯丙酯依次为0.002 044、0.005 110、0.010 22、0.020 44、0.051 10 g·L-1，羟苯丁酯依次为0.002 270、0.005 675、0.011 35、0.022 70、0.056 75 g·L-1的线性对照品溶液，按照上述色谱条件分别进样10 μL测定，以峰面积Y对质量浓度X作线性回归，得苯甲酸、山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯的回归方程及线性范围见表1。

表1　6种防腐剂标准曲线的回归方程及线性范围

2.4检测限精密量取不同体积对照品储备液，用10%甲醇溶液逐步稀释，按上述色谱方法进样，记录色谱图，当所测的信噪比为3∶1时，苯甲酸、山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯对应的质量浓度分别为0.000 210 2、0.000 108 0、0.000 148 3、0.000 140 3、0.000 136 3、0.000 227 0 g·L-1。

2.5精密度实验取含苯甲酸、山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯浓度分别为0.010 51、0.010 80、0.011 12、0.010 52、0.010 22、0.011 35 g·L-1的对照品溶液，连续进样6次，按上述色谱条件分别测定，结果测得6次苯甲酸、山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯的峰面积的RSD均在0.3%以内。实验结果表明，本方法精密度良好。

2.6重复性实验取批号为50214063的样品，按2.2项下方法制备供试品溶液6份，按上述色谱条件分别进样测定，将测得的峰面积代入标准曲线计算，结果本品中苯甲酸的含量为1.7 g·L-1，RSD为2.0%，山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯均未检出。实验结果表明，本方法重复性良好。

2.7回收率实验精密量取已知苯甲酸、山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯含量的批号为20150501的样品6份，每份1 mL，置100 mL量瓶中，加对照品储备液10 mL，用10%甲醇溶液稀释到刻度，摇匀，滤过，取续滤液，按上述色谱条件分别进样测定，将测得的峰面积代入标准曲线计算回收率。苯甲酸、山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯回收率分别为99.5%，97.2%，100.4%，100.6%，100.3%和100.1%，RSD分别为1.5%，1.7%，1.4%，2.2%，2.0%和1.3%。实验结果表明，本方法回收率良好。

2.8样品测试取样品，按“2.2”项下供试品溶液的制备方法制样测定，对定量时超出标准曲线范围的样品溶液用10%甲醇溶液准确稀释后再测定，结果22批样品中均检出有防腐剂，结果见表2，色谱图见图1。

表2　防腐剂测定结果/g·L-1

注：1.苯甲酸；2.山梨酸；3.羟苯甲酯；4.羟苯乙酯；5.羟苯丙酯；6.羟苯丁酯；A.批号为20150501的样品溶液色谱图；B.批号为150102的样品溶液色谱图；C.批号为50214063的样品溶液色谱图；D.批号为140833的样品溶液色谱图；E.批号为141201的样品溶液色谱图；F.批号为20150317-2的样品溶液色谱图；G.批号为C141216的样品溶液色谱图；H.对照品溶液色谱图；I.空白溶液色谱图。

图1典型色谱图

3讨论

3.1变波长检测程序的设计采用UV-HPLC法进行分析检测时，一般采用目标化合物的最大吸收波长来提高检测灵敏度。但在多组分测定时，往往由于目标化合物的最大吸收波长差异较大，因此需要选择合适的波长以保证所有组分都能达到一定的灵敏度。通过扫描，苯甲酸的最大吸收波长为230 nm、山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯和羟苯丁酯的最大吸收波长为254 nm。对于沃特世2489紫外检测器，可以选择双通道(但数据采样率只有每秒1点)，也可选择程序变波长(数据采样率最高可设每秒10点)以提高色谱峰的逼真度。根据6种化合物在本实验色谱条件下的出峰时间，设计变波长检测程序如下：0～5.5 min，检测波长230 nm，检测苯甲酸；5.5～30.0 min，检测波长254 nm，检测其他5种防腐剂，选择在不同时间段分别用各组分的最佳吸收波长进行检测，不但可以提高检测灵敏度，还能减小干扰。

3.2梯度洗脱程序的优化由于苯甲酸和山梨酸的相对分子质量和极性非常接近，而羟苯酯类在C18柱上保留性又较强，因此需要采用梯度洗脱的方法，才能在适宜的时间内分离这6种防腐剂。试验过程中，曾对相关文献中使用的流动相筛选和优化，最终选择了甲醇-0.02 mol·L-1乙酸铵溶液体系进行梯度洗脱。首先在较低的有机相比例(30%)保持6 min，使苯甲酸和山梨酸达到基线分离，然后以适宜的速率使有机相比列达到70%并保持7 min，使4种羟苯酯类和其他组分流出。在此梯度洗脱条件下，6种防腐剂分离良好，峰形良好，其他组分无干扰。

3.3检测结果的分析22批样品中均检出了防腐剂，同一企业防腐剂的使用种类和浓度基本保持稳定，但不同企业之间浓度差异较大，值得关注。《中国药典》只是规定了糖浆剂中防腐剂的种类和限量[9]，但缺少相应的测定方法,容易导致部分企业在防腐剂的使用上缺乏严格的管理，因此应加强对防腐剂使用的监管，以确保广大人民群众用药安全有效。

参考文献

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[3]国家卫生和计划生育委员会.食品添加剂使用标准GB2760—2014[S].北京:中国标准出版社,2014.

[4]李海燕,刘治安,莫炫永,等.HPLC 法同时测定布洛芬口服液体制剂中布洛芬、苯甲酸钠的含量[J].中国药房,2012,23(24):2286-2288.

[5]江文明,金薇,宋冬梅,等.HPLC 法测定盐酸氨溴索口服液体制剂中防腐剂含量[J].药物分析杂志,2012,32(10):1838-1841.

[6]罗晶,施法,陈晓辉,等.HPLC法同时测定抗病毒口服液中4种防腐剂[J].西北药学杂志,2012,27(1):36-38.

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[8]董桂贤,王朝霞,张桂芳,等.超高效液相色谱法同时测定酱腌菜中的7种防腐剂与2种甜味剂[J].中国食品卫生杂志,2013,25(2):155-159.

[9]国家药典委员会.中国药典(四部)[S].北京：中国医药科技出版社，2015：20.

Simultaneous determination of six preservatives in ibuprofen suspension by HPLC with variable wavelength UV detection

WANG Fa，WANG Sun-xuan，LIU Xue-feng，et al

(ShaanxiInstituteforFoodandDrugControl,Xi′an,Shaanxi710061,China)

Abstract:ObjectiveA method of simultaneous determination of six preservatives in ibuprofen suspension by HPLC with variable wavelength UV detection was established.MethodsThe Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)column was used,methanol-0.02 mol·L-1ammonium acetate was used as mobile phase in gradient elution mode at the flow rate of 1.0 mL·min-1,and the temperature of column was 30 ℃.The analyte was determinedwith variable wavelength detector.With the qualitative retention time,the peak area was quantified by the standard curve method.ResultsSix preservatives were well separated,the calibration curves were linear in the range of 0.002～0.05 g·L-1(r≥0.999),and the average recoveries were between 97.2% and 100.6%,RSD≤2.2%.ConclusionsThe method was simple,accurate,so it is proposed for quantitative and qualitative determination of preservatives in ibuprofen suspension.

Key words:Preservatives,pharmaceutical/analysis;Chromatography,high pressure liquid;Ibuprofen;Suspensions

作者简介：王发，男，副主任药师，研究方向：药物分析，E-mail:wangf1974@126.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.014

(收稿日期：2016-03-14，修回日期：2016-05-03)