武文丽，颜家保，陈佩，霍晓琼，吴优，胡茜茜（武汉科技大学化学工程与技术学院，湖北 武汉 430081）



研究开发

炼油废水中好氧反硝化菌的筛选及降解特性

武文丽，颜家保，陈佩，霍晓琼，吴优，胡茜茜
（武汉科技大学化学工程与技术学院，湖北 武汉 430081）

摘要：为了提高炼油废水生物处理装置的反硝化性能，从武汉石化污水处理厂的活性污泥中筛选出一株好氧反硝化菌AD10，经生理生化及16S rDNA序列分析，将其鉴定为假单胞菌属。通过单因素实验研究了该菌的最适培养条件：以丁二酸钠为碳源，C/N=14，温度30℃，初始pH=6.0，摇床转速200r/min。在此条件下，ρ（NO3--N）= 556.81mg/L时72h的去除率为97.2%，且耐受的硝酸盐氮质量浓度达到654.00mg/L。菌株AD10培养11.5 h，对ρ（NO3--N）=140.31mg/L和ρ（TN）=141.62mg/L的去除率分别为95.8%和93.9%，其反硝化速率高于大部分已发现的好氧反硝化菌，检测到的ρ（NO2--N）≤2.30mg/L，未出现明显的积累，菌株AD10能够进行完全反硝化。

关键词：炼油废水；假单胞杆菌；好氧反硝化；硝酸盐氮；总氮

第一作者：武文丽（1990—），女，硕士研究生。联系人：颜家保，教授，博士生导师。E-mail 121135637@qq.com。

传统生物脱氮是由好氧硝化作用和厌氧反硝化作用共同完成的，这两个过程需在不同的反应器中分开进行，工艺耗时且运行费用高、操控复杂、能耗大［1］。近年来，国内外的研究表明，反硝化也可以在有氧条件下进行，1983年ROBERTSON等［2］首次分离出了好氧反硝化菌，目前具有好氧反硝化功能的菌属有假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、副球菌属（Paracoccus）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、红球菌属（Rhodococcus）等［3-6］。好氧反硝化菌的发现，使得硝化作用和反硝化作用能在同一反应器内进行，克服了传统工艺成本高、效率低的问题［7］，在好氧条件下进行同时硝化反硝化是目前废水生物处理中的研究热点，也是生物脱氮中的重点研究方向。

本实验从炼油废水活性污泥中分离鉴定出 1株好氧反硝化菌AD10，对菌株生长及其反硝化性能的影响因素如碳源种类、C/N、温度、pH值等进行了考察，同时考察了其对硝酸盐氮的耐受性，并研究了反硝化过程中亚硝酸盐氮和总氮的变化规律，以期为其应用于炼油废水生物脱氮提供理论支持。

1 实验材料和方法

1.1 材料

活性污泥:采自中国石化武汉石油化工厂炼油废水生化处理装置。

LB培养基（g/L）:酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl 10，自然pH值。

好氧反硝化培养基（g/L）:Na2HPO4·12H2O 7.9，KH2PO41.5，KNO31.0，MgSO40.1，FeSO4·7H2O 0.01，微量元素溶液2mL，pH=7.0。微量元素储备液，见文献［8］。

1.2 实验方法

1.2.1 好氧反硝化菌株的筛选

将活性污泥接入LB培养基中活化，后转接至好氧反硝化培养基中进行驯化，过程中ρ （NO3--N）从100～600mg/L梯度增加，驯化3～4次。通过稀释涂平板及平板划线法得到若干株好氧反硝化菌；对各菌株进行反硝化性能测试，将性能最好的1株作后续研究。

1.2.2 好氧反硝化菌株的鉴定

菌株的初步鉴定依据《常见细菌系统鉴定手册》［9］进行；基因组DNA的提取及PCR产物纯化/回收均通过试剂盒完成，试剂盒由北京鼎国生物技术有限公司提供；16S rDNA测序工作委托武汉擎科生物技术有限公司进行。

1.2.3 菌株的生长及反硝化性能

按φ（A）=3%的接种量，将活化至对数期的种子液接入好氧反硝化培养基中，培养基初始ρ（NO3--N）≈140mg/L，在一定培养条件下，分别考察碳源种类、C/N、培养温度、初始pH值、摇床转速等对菌体生长及反硝化性能的影响；在优化条件下，考察了菌株对硝酸盐氮的耐受性，并研究了菌株在反硝化过程中亚硝酸盐氮和总氮的变化规律。

1.3 分析方法

NO3--N测定采用酚二磺酸法［10］；NO2--N测定采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法［10］；总氮测定采用过硫酸钾氧化紫外分光光度法［10］；菌体浓度（OD600）采用比浊法［11］测定。

2 结果与讨论

2.1 菌种鉴定

2.2.1 形态学鉴定

经富集驯化、分离纯化，共得到19株好氧反硝化菌，将性能最好的1株命名为AD10。图1为AD10菌落形态及革兰氏染色图片，从图1可以看出，菌落呈圆形，乳白色，表面光滑湿润，边缘整齐，有荧光绿色素产生，革兰氏染色呈阴性。生理生化试验结果表明:吲哚试验、V-P试验呈阴性，而淀粉水解试验、甲基红试验、糖酵解试验呈阳性。

图1 AD10菌落形态及革兰氏染色图片

2.2.1 16S rDNA鉴定

PCR扩增产物经16S rDNA测序分析后，获得长为1419 bp的碱基序列，将其输入到GenBank中进行Blast比对，表1为部分与AD10同源性较高的菌株。可以看出，与AD10同源性达99%以上的菌株均为假单胞菌属（Pseudomonas sp.），结合其形态学及生理学特征，将菌株AD10鉴定为假单胞菌属。

表1中的各菌株分别为硝基苯降解菌、喹啉降解菌、吡嘧磺隆降解菌、产硫酸酯酶菌、邻苯二酚降解菌、尼古丁降解菌等，虽与AD10有很高的同源性，但它们并不具有好氧反硝化性能。

表1 菌株AD10 16S rDNA序列比对结果

2.2 AD10生长及培养条件的选择

2.2.1 碳源的选择

将活化后的种子液接入5种不同碳源的好氧反硝化培养基中，在30℃、200r/min条件下，碳源种类对菌株生长及反硝化性能的影响见图 2。由图 2可知，菌株生长越快，硝酸盐氮降解效果越好；以丁二酸钠为碳源时效果最佳（11h的脱氮率为88.2%），柠檬酸钠次之，蔗糖效果最差。反硝化速率受碳源种类的影响很大，丁二酸钠分子结构简单，可直接以酸的形式被反硝化菌利用，而糖类必须被分解为有机酸才能被吸收，这与李慧颖［12］、周云云［13］等的研究结果类似。因此，在后续实验中，培养基碳源选丁二酸钠。

2.2.2 C/N的选择

王薇［14］等的研究表明，C/N是影响好氧反硝化菌反硝化作用的主要因素。以丁二酸钠为碳源的好氧反硝化培养基中，初始ρ（NO3—-N）≈140mg/L，在30℃、200r/min条件下，图3为C/N对菌体生长及反硝化速率的影响。由图3可知，在一定范围内，C/N越高，菌体生长和反硝化速率越快；C/N为12 和 14时，二者的生长曲线和降解曲线几乎各自重合，培养11h的脱氮率分别为90.5%和91.4%，此时C/N不再是反硝化的限制因素，继续增大C/N已无明显作用。因此，在后续实验中，培养基C/N选为14。

2.2.3 温度的选择

图2 碳源种类对菌体生长及ρ（NO3--N）的影响

图3 C/N对菌体生长及ρ （NO3--N）的影响

图4 培养温度对菌体生长及ρ（NO3--N）的影响

温度主要影响微生物体内酶的活性，从而影响其生长代谢的速率。将活化后的种子液接入C/N=14的好氧反硝化培养基中，在200r/min条件下，温度对菌株生长及反硝化速率的影响见图4。由图4可以看出，温度过高或过低都不利于菌株的生长及代谢；当温度为30℃时，菌株生长及反硝化效果最好，经 10.5h的培养，菌株 AD10对质量浓度为144.58mg/L的硝酸盐氮的降解率为92.2%，因此，将菌株AD10的培养温度选为30℃。

2.2.4 初始pH值的选择

图5为30℃、200r/min条件下，培养基初始pH值对菌株生长及反硝化速率的影响。由图5可知，菌株AD10在弱酸及中性环境中活性较高，这与反硝化过程产碱有关；培养基pH值为6.0和7.0时，菌株培养10.5h，硝酸盐氮的降解率分别为93.8%和91.2%，而碱性环境（pH≥9.0）对菌株生长及硝酸盐氮的降解均有抑制。在后续实验中，培养基 pH值调至6.0。

2.2.5 摇床转速的选择

刘欢等［1］研究认为，好氧反硝化菌体内的周质硝酸盐还原酶在有氧条件下可将硝酸盐还原，而培养液中溶氧浓度的大小与摇床转速密切相关。图 6 为30℃、培养基pH值为6.0时，不同摇床转速对菌株生长及反硝化速率的影响。由图6可知，在一定转速范围内，菌株的反硝化速率随转速的增大而增大，在200r/min时达到最大；经10.5h的培养，菌株AD10对ρ（NO3--N）=138.02mg/L的降解率达96.0%，这表明好氧反硝化酶与有氧呼吸系统同时存在于AD10体内，且较高溶氧浓度更有利于反硝化作用的进行。

2.2.6 菌株对硝酸盐氮的耐受性

将菌株AD10接种于C/N=14、pH=6.0的好氧反硝化培养基中，在优化条件下，不同 ρ（NO3--N）对反硝化速率的影响见图7。从图7可以看出，培养基中硝酸盐氮浓度越低，越容易降解；当ρ（NO3--N）≤557mg/L时，菌株反硝化作用均较彻底，经一段时间的培养，脱氮率可达95%～98%；高浓度的硝酸盐氮会抑制菌株的反硝化作用，ρ（NO3--N）=654mg/L时，72h的降解率为65.1%，表明菌株AD10至少可耐受质量浓度为654 mg/L的硝酸盐氮。

2.2.7 优化条件下菌株的好氧反硝化作用

图5 pH值对菌体生长及ρ （NO3--N）的影响

图6 摇床转速对菌体生长及ρ （NO3--N）的影响摇床转速

图7 菌株对硝酸盐氮的耐受性

将菌株AD10活化后接种于 C/N=14、pH=6.0的好氧反硝化培养基中，在优化条件下，菌株的好氧反硝化作用见图8。由图8可以看出，菌株能有效去除培养液中的总氮及硝酸盐氮，且二者的降解曲线趋势同步，菌株经 11.5h的培养，对初始ρ（NO3--N）=140.31mg/L和初始 ρ（TN）=141.62mg/L的去除率分别为95.8%和93.9%。周影茹等［15］分离出的RWX31对初始NO3--N浓度为140mg/L时24h的去除率为82%，王慧荣等［16］分离出的菌株CW培养24h对ρ（NO3--N）=108mg/L的去除率为75%，高喜燕等［17］分离出的菌株2-8培养48h对ρ（NO3--N）=140mg/L的降解率为92%；而本研究筛选得到的AD10其反硝化速率均高于它们。

图8 菌株AD10的反硝化性能研究

在该茵的反硝化过程中，检测到的 ρ（NO3--N）≤2.30mg/L，并未出现明显的积累，原因可能是反硝化作用产生的NO2--N在亚硝酸还原酶的作用下直接被还原为含氮气态产物，这表明菌株AD10能够进行完全反硝化。

3 结 论

（1）从武汉石化污水处理厂的活性污泥中筛选出一株好氧反硝化菌 AD10，经鉴定为假单胞菌属。

（2）该菌最适培养基条件为:以丁二酸钠为碳源，C/N=14，初始 pH=6.0。最适培养条件为:温度30℃，摇床转速200r/min。

（3）在优化条件下，ρ（NO3--N）=556.81mg/L时，72h的去除率为97.2%，且能耐受的硝酸盐氮质量浓度为654mg/L。

（4）菌株 AD10培养 11.5h，对ρ（NO3--N）= 140.31mg/L和ρ（TN）=141.62 mg/L的去除率分别为95.8%和93.9%，反硝化速率高于大部分已发现的好氧反硝化菌；且检测到的ρ（NO3--N）≤2.30mg/L，并未出现明显的积累，表明菌株AD10能够进行完全反硝化。

参 考 文 献

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Screening of an aerobic denitrifier from refinery wastewater and its characteristics

WU Wenli，YAN Jiabao，CHEN Pei，HUO Xiaoqiong，WU You，HU Qianqian
（College of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430081，Hubei，China）

Abstract:In order to improve the denitrification efficiency of the bioreactor of refinery wastewater treatment plant，an aerobic denitrifier AD10 was isolated from the activated sludge of a petrochemical wastewater treatment plant in wuhan city. It was identified as a member of the genus Pseudomonas sp. according to its morphyological and physiological properties and 16S rDNA gene sequence analysis. Through the single factor experiment investigations，the optimum denitrification conditions were: sodium succinate as carbon source，C/N 14，temperature 30℃，initial pH 6.0，rotation speed 200 r/min. Under these conditions，the nitrate remove efficiency of AD10 was 97.2% when it was cultivated in 556.81 mg/L nitrate for 72h，and it could tolerate at least 654 mg/L of nitrate nitrogen. Culturing after 11.5h，AD10 show the NO3--N and TN removal rate of 95.8% and 93.9%，when the concentration of NO3--N and TN were 140.31mg/L and 141.62mg/L，respectively. AD10's denitrification rate is higher than most of the aerobic denitrifying bacteria have been found. During this process，only a very small amount of NO2--N （≤2.30mg/L） was detected，indicating a complete denitrification.

Key words:refinery wastewater；Pseudomonas sp.；aerobic denitrification；nitrate nitrogen；total nitrogen

中图分类号：X 172

文献标志码：A

文章编号：1000-6613（2016）05-1524-05

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.05.039

收稿日期：2015-9-17；修改稿日期：2015-10-29。

基金项目：武汉科技大学研究生创新创业基金重点项目（JCX0006）及武汉科技大学国家级大学生创新创业训练计划项目（201310488009）。