钱丽波　王珏　钱源　肖雪　郭知　杨建林　杨继青　张兰　马润玫

(1．云南省红河州第三人民医院　产科，云南　个旧　661000；2．昆明医科大学妇产科细胞遗传实验室，云南　昆明　650032)

荧光原位杂交在产前诊断中与无创DNA检测的对比研究

钱丽波1王珏2钱源2肖雪2郭知2杨建林2杨继青2张兰2马润玫2

(1．云南省红河州第三人民医院产科，云南个旧661000；2．昆明医科大学妇产科细胞遗传实验室，云南昆明650032)

【摘要】目的研究荧光原位杂交技术与无创DNA检测在快速诊断胎儿染色体数目异常的价值。方法使用荧光原位杂交技术(FISH)，应用特异性探针对包含5例无创DNA确诊异常病例的372例胎儿羊水细胞进行荧光原位杂交。结果荧光原位杂交共检出染色体数目异常20例，异常率为5.4%，包括唐氏患儿14例，占全部异常数的70%，18-三体综合征3例，45，X2例，XXY1例，其中无创DNA送检的5例异常病例中有4例均为唐氏患儿，比例为80%，荧光原位杂交检测结果与羊水细胞核型分析结果相比较，在染色体数目异常方面两者符合率为95.2%(20/21)。结论FISH技术用于快速诊断羊水细胞13、18、21、X，Y染色体数目时具有较高的临床价值，但不能作为单独的方法检测染色体异常，而无创DNA检验可作为产前筛查新技术向特定孕妇推广。

【关键词】荧光原位杂交技术； 无创DNA检测； 产前诊断； 染色体异常

染色体异常是造成新生儿缺陷的一类常见病因，发生率约1/120，其中约50%导致生长发育迟缓、智力落后、多发畸形及性发育异常等临床表征。由于缺乏合适的治疗方法，目前唯一的预防方法只有通过产前诊断来避免此类患儿的出生。较为普遍的胎儿染色体产前诊断方法是细胞遗传学染色体核型分析，该技术需要对处于分裂中期的细胞进行，准确性高，但需细胞培养后进行染色体制备，由于其操作过程长且技术复杂，结果一般需要2周甚至更长的时间。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是一种非放射性原位杂交技术，利用特殊的荧光素标记DNA探针进行DNA杂交，经免疫荧光显色，可检测细胞内特异DNA存在与否，能快速、准确地确定细胞分裂间期核染色体非整倍体畸变[1]。胎儿染色体非整倍体的无创DNA产前检测(noninvasive prenatal testing，NIPT)，是利用大规模平行测序技术(massively parallel sequencing，MPS)对母体外周血中的游离DNA进行深度测序，获取胎儿染色体信息的方法。由于该方法不需羊水穿刺等有创方法来获得胎儿细胞，而且检测时间较短，可在孕早期进行检测，目前正处于快速的发展阶段，随着大规模的临床试验的验证，有望代替侵入性的产前诊断方法。本研究使用国产试剂盒对372例羊水样本的染色体数目异常进行快速诊断，并同时使用羊水培养进行常规染色体核型分析，由于羊水样本中有5例是NIPT确诊异常送检，可同时比较三者结果以此探讨其临床应用价值。

1材料和方法

1.1研究对象选择本院自2012年6月至2014年5月期间进行羊膜腔穿刺的妊娠妇女共372名，其中5例为NIPT确诊染色体异常送检。所有羊水均培养成功进行核型分析。孕妇年龄21～43岁，孕周为18～24周。

1.2研究方法

1.2.1羊水采集在B超引导下，用21G PTC穿刺针经腹壁抽取羊水25m1，置于无菌注射器中。留取5m1用于FISH检测，其余用于细胞培养。

1.2.2羊水细胞FISH检测步骤包括制片、杂交、洗脱和镜检部分。详细操作参考金菩嘉公司操作手册，并结合本实验室的条件。共使用5种染色体探针，分为2组，即13/21组和18/X/Y组。13/21组的探针分别标记位于13q14(绿色)和21q22(红色)处。18/X/Y探针分别定位于18，X，Y的p11.1-q11.1区域，分别标记水蓝色、绿色和红色。

1.2.3NIPT送检本实验中5例NIPT送检结果分别由贝瑞何康公司送检4例，深圳华大基因公司送检1例，具体实验操作参考其公司操作手册。

1.2.4结果判读本实验中FISH结果判别时，每张羊水玻片至少计数50个细胞。若正常细胞数≥85%则判为异常，若异常细胞数≥65%则判为异常，若异常细胞数>15%，并且<60%,则需要加倍计数到100个细胞。

2结果

采用13/21号和18/X/Y染色体荧光探针检测372例羊水间期核细胞。检出染色体异常20例，唐氏患儿14例，占全部异常数的70%，18-三体综合征3例，45，X2例，XXY1例，检测结果与培养后羊水细胞核型检测结果一致。详见表1.

采用羊水细胞核型分析检测372例羊水细胞，全部培养成功，其中检出染色体异常21例，除一例为46，XX[14]/47,XX,+mar[21]外，其余结果均与FISH检测的染色体结果一致。在诊断染色体数目异常上，FISH检测结果与羊水细胞核型分析的符合率为95.2%。

表1　 FISH实验结果和细胞遗传学实验结果对照表(共21例异常)

3讨论

唐氏综合征是最常见的染色体非整倍体疾病[2]，其他比较常见的染色体非整倍体疾病包括18-三体、13-三体、Turner综合征。目前诊断胎儿染色体非整倍体疾病唯有通过侵入性产前诊断操作，如绒毛活检、羊膜腔穿刺获得样本。传统的羊水细胞培养检测方法细胞培养周期较长，容易给孕妇带来焦虑感，也给临床带来不便。FISH检测技术通过用已知的单链核酸探针，与标本中未知单链核酸结合，形成可检测的杂交双链核酸，不需要经过细胞培养阶段，因其快速、准确、灵敏度高、特异性强的突出特点弥补了长期以来仅依靠细胞遗传学产前诊断的不足和局限性，一定程度上避免了培养失败的缺陷，实现了快速诊断染色体异常的可能。

由于侵入性操作可能会带来的流产风险，目前利用血清学生物标记物、超声等对普通妊娠人群进行筛查，筛选出进一步行产前诊断的高危人群显得尤为重要[3]。但是经过传统的筛查方法大约仍有5%的孕妇需要行侵入性操作，且仅有30%的胎儿会发现异常[4]。即使经过数十年的努力，联合筛查方法的应用能使检出率提高90%以上，但仍要有3%～5%的人群需行侵入性操作[5]。自从1997年，香港中文大学的卢煜明教授等[6]首先在母血浆中发现了胎儿游离DNA(cell free fetal DNA，cffDNA)，在正常妊娠过程中cffDNA几乎全部来源于胎盘的滋养层细胞。由于cffDNA在孕7周胎儿胎盘循环建立后，就可以一定比例稳定的存在于母体外周血中，且其半衰期只有16.3分钟，在正常分娩2小时后在母体外周血中已检测不到。因此cffDNA检测不受孕周与年龄的限制，这使无创产前诊断成为可能。目前，随着MPS的飞速发展，国内外研究人员进行了大量的临床试验。Palomaki等[7, 8]的研究验证了MPS对高危妊娠母体血浆胎儿T21的检测拥有近99%的灵敏度和特异度。随后该小组又发表一项研究显示，MPS全基因组随机测序技术对T18检测的灵敏度为100%，假阳性率为0.28%，对T13检测的灵敏度为91.7%，假阳性率为0.97%。同时NIPT还可检测其他染色体非整倍体，包括易位型三体及嵌合型三体，对特纳综合征(45X)检测的灵敏度为93.8%，特异度为99.8%。

本研究中羊水FISH检测结果与羊水培养成功的372例结果相比，在检测13号，18号，21号，X，Y染色体异常上，20例结果相符，所有唐氏患儿均被检出。FISH漏检一例46，XX [14]/47,xx,+mar [21]。FISH漏检是因为易位区域或倒位在探针检测范围之外，这些染色体结构异常会被遗漏，是FISH实验的主要局限性。FISH应该与羊水细胞遗传学检测即染色体核型分析相结合，才能全面地诊断胎儿染色体疾病，FISH技术能否单独作为产前诊断的方案供临床选择，值得商榷。

而对于NIPT送检的5例样本，其中有4例经检测均为唐氏患儿，与其送检的检测报告相符。而其中一例送检时检测报告为45,X，经FISH和细胞遗传学检测均为正常，未发现其他异常。由此我们可以看出NIPT对于21号染色体具有较高的灵敏度的特异度，而对于非整倍体的X的检出目前特异度还不是很理想，尚需进一步的研究和验证。

相比于其他的筛查手段，我们可以看出NIPT技术在灵敏度和特异度方面有无可比拟的优势，但是由于现在MPS技术尚未大规模普及而且成本偏高，我们仍然不支持所有孕妇为了避免有创的羊水穿刺而选择NIPT。目前国内的产前诊断技术专家组于2012年就NIPT进行了论证，边旭明等指出，该检测技术是一种“近似于诊断水平”、“目标疾病指向精确”的产前筛查新技术，目前其临床适用人群包括：①有介入性产前诊断禁忌证者(先兆流产、发热、有出血倾向、感染未愈等)；②产前筛查高危或临界高危孕妇；③珍贵儿，知情后拒绝介入性产前诊断的孕妇；④对介入性产前诊断极度焦虑的孕妇；⑤就诊时处于较大孕周、超出目前产前筛查范围的孕妇[9]。

随着将来测序技术的进一步发展，NIPT的检测成本将不再成为该技术广泛应用的瓶颈。而更大规模的NIPT临床试验也将进一步提高其准确性，NIPT的加入会极大的减少孕妇不必要的羊水穿刺，从而有效的提高我国产前筛查和产前诊断水平，也为孕妇们带来福音。

参 考 文 献

[1] Witters I, Devriendt K, Legius E, et al. Rapid prenatal diagnosis of trisomy 21 in 5049 consecutive uncultured amniotic fluid samples by fluorescence in situ hybridisation (FISH)[J]. Prenat Diagn,2002,22(1):29-33.

[2] Sherman SL, Allen E G, Bean LH, et al. Epidemiology of Down syndrome[J]. Ment Retard Dev Disabil Res Rev,2007,13(3):221-227.

[3] Wiseman FK, Alford KA, Tybulewicz VL, et al. Down syndrome--recent progress and future prospects[J]. Hum Mol Genet,2009,18(R1):R75-R83.

[4] Malone FD, Canick JA, Ball RH, et al. First-trimester or second-trimester screening, or both, for Down's syndrome[J]. N Engl J Med,2005,353(19):2001-2011.

[5] Wald NJ, Huttly WJ, Hackshaw AK. Antenatal screening for Down's syndrome with the quadruple test[J]. Lancet,2003,361(9360):835-836.

[6] Lo YM. Fetal DNA in maternal plasma: biology and diagnostic applications[J]. Clin Chem,2000,46(12):1903-1906.

[7] Palomaki GE, Deciu C, Kloza EM, et al. DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study[J]. Genet Med,2012,14(3):296-305.

[8] Canick JA, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, et al. DNA sequencing of maternal plasma to identify Down syndrome and other trisomies in multiple gestations[J]. Prenat Diagn,2012,32(8):730-734.

[9] 边旭明. 胎儿染色体非整倍体的无创DNA产前检测[J]. 实用妇产科杂志，2013，5:330-333.

编辑：宋文颖

【Abstract】ObjectiveTo investigate the clinical value of fluorescence in situ hybridization(FISH) and noninvasive prenatal testing(NIPT) in rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy of fetus. MethodWith FISH technique, chromosome-specific DNA probe were used to detected 372 uncultured amniotic fluid samples included 5 abnormal samples detected by NIPT. Results20 cases of chromosome abnormal have been detected, the ratio is 5.4%,included 14 cases of Down syndrome(DS), 3 cases of trisomy 18 syndrome，2 cases of 45,X and 1 cases of XXY. The 5 abnormal cases send by NIPT have detected 4 cases of DS, the ratio is 80%. The coincidence rate of diagnosis between FlSH and conventional cytogenetics was 95.2%(20/21)．ConclusionsFISH technique has high clinical value for rapid detecting of fetus chromosome aneuploidy, but it can’t be taken to detect chromosome abnormalities alone, and the NIPT can be a new prenatal screening to popularize.

【Key words】FISH； NIPT； prenatal diagnosis； chromosomal abnormality

DOI:10.13470/j.cnki.cjpd.2016.01.007

【中图分类号】R394

【文献标识码】A

(收稿日期：2015-02-21)