牛 庆 昌，　李　 成，　梁 雯 婧，　马　俊，　随 瑞 瑞，　张　洋，　丛 丽 娜

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连　116034 )

海参溶菌酶C端多肽的异构肽酶活性

牛 庆 昌，李 成，梁 雯 婧，马俊，随 瑞 瑞，张洋，丛 丽 娜

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连116034 )

摘要:海参溶菌酶C端多肽与5种异构肽酶的氨基酸残基序列比对发现，其具有较高同源性，维持异构肽酶活性的两个关键位点组氨酸(His)和丝氨酸(Ser)也高度保守。水解底物L-γ-Glu-pNA生成4-硝基苯胺的实验结果表明，C端多肽具有异构肽酶活性。丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF能有效破坏蛋白酶活性，表明Ser是异构肽酶rSjLys-C的关键活性位点，即rSjLys-C属于丝氨酸蛋白酶。确定最适催化条件为37 ℃、pH 7.4、NaCl 50 mmol/L。rSjLys-C的酶促反应动力学参数Vmax为1.446×10-5mmol/(L·s)，Km为0.395 7 mmol/L，kcat为1.509×10-3s-1，kcat/Km为23.813 L/(mol·s)。

关键词:海参；溶菌酶；异构肽酶；活性位点

0引言

作为免疫系统的组成成分，溶菌酶在海参机体内具有重要作用，对许多病原菌具有较强的抑菌活性[1-3]。近期研究表明，作为i型溶菌酶，海参溶菌酶(SjLys)属于“多功能蛋白”，除了具有抑菌活性，还可能具有异构肽酶活性[4-6]。作为丝氨酸蛋白酶，异构肽酶(isopeptidase)通过水解赖氨酸和谷氨酸间的异肽键，降解纤维蛋白及其类似物[7-9]。Cong等[1]研究发现,海参溶菌酶蛋白的C端区域(49～125 aa，SjLys-C)与水蛭异构肽酶氨基酸序列高度保守，可能是蛋白异肽酶活性的重要功能区。研究SjLys-C蛋白的异构肽酶活性，可以进一步分析海参溶菌酶蛋白的性质、作用和功能。同时，不溶性的纤维蛋白是引发血栓的重要原因之一，SjLys-C蛋白异构肽酶活性的研究也为海参在医药方面中治疗各种血栓引起的病症提供重要的参考价值[10-11]。

本实验利用体外重组表达的海参溶菌酶C端多肽(rSjLys-C)检测其异构酶活性，为深入研究rSjLys-C性质提供理论基础，为充分发挥异构肽酶活性提供必备的理论条件。

1材料与方法

1.1试剂与仪器

DH5α和Rosetta-GamiB(DE3)pLysS，上海北诺生物科技有限公司；Rosetta-GamiB (DE3)pLysS/pET-32a-SjLys-C基因工程菌，本实验室构建；质粒提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司；Protein markers，大连宝生物有限公司；Ni2+-NTA亲和层析填料，GE healthcare公司。

1.2方法

1.2.1氨基酸序列同源性分析

利用多序列比对软件Cluster X[12]对SjLys蛋白的C-domain和5种异构肽酶的氨基酸序列进行序列比对，分析序列的同源性和结构域的保守性。其中，水蛭(Hirudomedicinalis)，安德爱胜蚓(Eiseniaandrei)，花蛤(TapesJaponica)，美洲板口线虫(Necatoramericanus)，鲁本斯海星(Asteriasrubens)的氨基酸序列来源于GenBank 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)。海参溶菌酶C端多肽氨基酸序列来源于GenBank数据库中的SjLys序列。

1.2.2融合蛋白rSjLys-C的表达与纯化

Rosetta-GamiB(DE3)pLysS/pET-32a-SjLys-C菌种活化后转接发酵培养，IPTG诱导表达后，离心收集菌体。菌体细胞超声破碎后，离心收集上清液。经Ni2+-NTA亲和层析纯化后， SDS-PAGE检测[13]。

1.2.3融合蛋白rSjLys-C异构肽酶的活性检测

以MOPS配制0.75 mg/mL rSjLys-C母液和0.50 mg/mL L-γ-Glu-pNA母液。将0.25 mg/mL rSjLys-C加入到0.33 mg/mL L-γ-Glu-pNA样品中，37 ℃水浴，每隔一段时间，测定405 nm处吸光度，检测rSjLys-C蛋白的异构肽酶活性[6]。

1.2.4PMSF对rSjLys-C蛋白异构肽酶活性的抑制作用

向反应体系内加入不同浓度的PMSF，对照组加入相应量的无水乙醇。37 ℃水浴反应20 h，测定405 nm处的吸光度，分析PMSF对蛋白异构肽酶活性的影响[14]。

1.2.5rSjLys-C蛋白异构肽酶活性的影响因素

以0.25 mg/mL L-γ-Glu-pNA为底物，在50 mmol/L MOPS (pH 7.0)，37 ℃水浴条件下，检测不同的蛋白质量浓度(25～300 μg/mL)的异构肽酶活性。37 ℃水浴条件下检测不同pH对蛋白异构肽酶活性的影响。在pH 7.4，50 mmol/L MOPS条件下，研究不同温度对活性的影响，并分析5～300 mmol/L NaCl离子强度对rSjLys-C异构肽酶活性的影响。

1.2.6酶反应动力学

绘制p-NA标准曲线，y=0.074 8x+0.000 4(R2=0.999 9)。

分析rSjLys-C蛋白的酶促反应动力学参数。rSjLys-C酶促反应条件：pH 7.4 50 mmol/L MOPS， 1～50 mmol/L，37 ℃。0.25 mg/mL rSjLys-C蛋白与不同浓度的底物反应。由标准曲线计算p-NA的生成量，绘制酶促反应曲线，求出不同底物反应的初始速度V0。以V0-[S]作图，经Origin 8.5非线性拟合，求出rSjLys酶促反应的Vmax、Km、kcat及kcat/Km[15]。

2结果与讨论

2.1SjLys-C氨基酸残基与其他异构肽酶序列同源性分析

Cong等[16]研究发现，海参溶菌酶蛋白C端多肽(SjLys-C)可能同时具有抑菌活性和异构肽酶活性。利用多序列比对软件发现，SjLys-C多肽序列上异构肽酶活性位点丝氨酸(Ser)和组氨酸(His)高度保守(如图1所示)。分布在活性位点周围的氨基酸残基(方框内)相对于其他位置也具有较高的同源性，形成高度保守序列：CS-(A/C)V(Q/R)-YM-RY(G/A)(T/V)和C(E/Q)(D/G)(F/Y)AR-HNGG-G。通常活性位点附近的氨基酸序列对酶活性和功能至关重要，是其发挥催化作用的结构域。序列比对结果表明，SjLys-C蛋白可能具有异构肽酶活性。

2.2重组rSjLys-C蛋白的分离纯化及鉴定

图2为重组海参溶菌酶C端多肽的诱导表达结果。由于带有标签，重组蛋白质rSjLys-C的分子质量为26.083 ku。实验结果显示，IPTG成功诱导宿主表达目的蛋白(1,2,4列)。经过Ni2+-NTA亲和层析纯化后得到高纯度的rSjLys-C。软件分析[17]rSjLys-C的纯度达95.37%，基本满足体外实验的要求。

2.3rSjLys-C异构肽酶活性的检测

L-γ-Glu-pNA作为特异性底物，能被异构肽

图1　海参溶菌酶C端多肽与其他异构肽酶氨基酸序列比对结果

M，标准蛋白分子质量；1，诱导前菌体总蛋白；2，诱导后菌体总蛋白；3，细胞破碎后沉淀；4，细胞破碎后上清总蛋白；5，Ni-NTA洗脱液

图2rSjLys-C的表达与纯化结果

Fig.2Expression and purification results of rSjLys-C

酶有效水解，生成对硝基苯胺(p-NA，橙黄色)[11]。以L-γ-Glu-pNA为底物，检测rSjLys-C的异构肽酶活性。由图3可知，rSjLys-C能有效地催化水解L-γ-Glu-pNA生成p-NA，表明rSjLys-C具有异构肽酶活性。

图3　rSjLys-C异构肽酶活性

2.4rSjLys-C异构肽酶活性位点

根据图1结果推测，海参溶菌酶C端多肽上Ser66是异构肽酶活性位点。丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF，通过进入丝氨酸蛋白酶的催化中心，与催化中心的丝氨酸反应，生成苯甲酰磺酰丝氨酸和HF，从而抑制了以Ser为主要酶活位点的丝氨酸蛋白酶的活性[14]。由图4可知，PMSF可以有效抑制rSjLys-C异构肽酶活性，表明Ser66为rSjLys-C蛋白的主要催化位点，即rSjLys-C属于丝氨酸蛋白酶超家族的一员。

图4　PMSF对rSjLys-C异构肽酶活性的影响

2.5rSjLys-C异构肽酶活性的影响因素

分别分析酶质量浓度、pH、离子强度及温度对rSjLys-C酶促反应的影响,结果如图6所示。当rSjLys-C质量浓度小于100 μg/mL，rSjLys-C的酶活性随质量浓度的增大而增强；100～350 μg/mL(图6(a))，rSjLys-C的催化程度100%。因此，选取0.025 mg/mL rSjLys-C和0.25 mg/mL L-γ-Glu-pNA进行实验。由图6(b) 可知，在pH 6.0～7.4，rSjLys-C具有较高的酶活，当pH=7.4时，蛋白异构肽酶活性最高；pH<6.0或pH>7.4时，蛋白异构肽酶活性明显下降。但rSjLys-C对pH具有较高的耐受性，在过酸(pH 4.0)或过碱(pH 9.0)的条件下，酶活仍维持在70%。图6(c)结果表明，rSjLys-C的异构肽酶活性对离子强度具有明显的依赖性。当NaCl浓度在50 mmol/L时，rSjLys-C异构肽酶活性最高；离子强度的降低或增加，都会降低其异构肽酶活性(图6(c))。温度对rSjLys-C酶活有较大影响(图6(d))。酶活的最适温度为37 ℃；当温度超过50 ℃时，异构肽酶的催化活性降低了80%。由此，确定最适酶反应条件为:温度37 ℃，pH 7.4，NaCl浓度50 mmol/L。

图5　酶质量浓度、pH、离子强度和温度对rSjLys-C异构肽酶活性的影响

图6　rSjLys-C异构肽酶活性的动力学分析

2.6rSjLys-C异构肽酶酶促反应动力学分析

rSjLys-C异构肽酶促反应动力学参数分别为Vmax=1.446×10-5L/(mol·s),Km=0.395 7 mmol/L，kcat=Vmax/[rSjLys-C]=1.509×10-3s-1，kcat/Km=3.813 L/(mol·s)。

1/Km表示酶对底物的亲和力。与其他的异构肽酶进行活性比较，分析rSjLys-C蛋白的异构肽酶活性。从表1中可以看出，rSjLys-C蛋白对底物的Km明显偏高，约为Medicinal leech失稳酶和Tapesjaponica异构肽酶两种蛋白的7.9～18.5倍，表明rSjLys-C蛋白对底物L-γ-Glu-pNA的亲和力较弱。这是由于rSjLys-C是重组蛋白。

表1　不同异构肽酶动力学参数

SjLys-C序列的N末端带有重组标签，His-Tag，Trx-Tag和S-Tag，导致在重组蛋白的三级结构中，海参溶菌酶C端多肽区域的氨基酸残基出现一定程度的包埋，从而影响蛋白rSjLys-C与底物的结合。

在同一种目标底物的条件下，酶促反应的动力学参数中的kcat和kcat/Km分别表示不同酶对底物的催化速率和催化效率。由表1可知，相较于另两种异构肽酶，rSjLys-C对底物催化速率高；且rSjLys-C对底物的催化效率是Tapesjaponica异构肽酶的3.56倍。

3结论

重组海参溶菌酶的C端多肽具有异构肽酶活性，虽然rSjLys-C对底物的亲和力较低，但是rSjLys-C对L-γ-Glu-pNA具有较高的水解速率和催化效率。实验为深入了解海参溶菌酶的性质，提供了其异构肽酶活性的理论基础。

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Elucidation of the isopeptidase activity for the recombinant C-domain polypeptide of sea cucumber lysozyme

NIUQingchang,LICheng,LIANGWenjing,MAJun,SUIRuirui,ZHANGYang,CONGLina

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:It was demonstrated that the catalytic sites of Ser and His for the isopeptidase activity were highly conserved and the amino acids around the key sites were highly homologous, compared with five isopeptidases of different species by Cluster X software. The result of rSjLys-C catalyzed L-γ-Glu-pNA to generate p-NA indicated that rSjLys-C possessed the isopeptidase activity. PMSF could destroy the isopeptidase activity of rSjLys-C effectively as a serine protease inhibitor, indicating that Ser66was the key active site of rSjLys-C. The results showed that the optimum reaction conditions were 37 ℃, pH 7.4, NaCl 50 mmol/L. Kinetic parameters for the isopeptidase activity of rSjLys-C were determined as follows: Vmax=1.446×10-5mmol/(L·s), Km=0.395 7 mmol/L, kcat=1.509×10-3s-1, kcat/Km=3.813 L/(mol·s).

Key words:sea cucumber; lysozyme; isopeptidase; catalytic site

收稿日期:2015-02-23.

基金项目:海洋公益性行业科研专项项目(201405003-3)；辽宁省高等学校重大科技平台专项项目(LT2011008)；辽宁省教育厅一般项目(L2014217).

作者简介:牛庆昌(1989-)，男，硕士研究生；通信作者：丛丽娜(1962-)，女，教授.

中图分类号:TS254.1；Q556.3

文献标志码:A

文章编号:1674-1404(2016)03-0162-05