王凤杰　王科坤　陈显兵　刘锦红　刘　昕

(湖北民族学院科技学院，恩施445000)



宫颈癌组织中硒结合蛋白1表达与肿瘤微环境中抗氧化酶活性有关①

王凤杰王科坤②陈显兵③刘锦红④刘昕④

(湖北民族学院科技学院，恩施445000)

[摘要]目的：探讨宫颈癌患者血清和组织中谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPx)活性和宫颈组织中硒结合蛋白1(Selenium Binding Protein 1，SBP1，SELENBP1)表达之间的相互关系，为SELENBP1在宫颈癌发生发展中的作用机制提供理论基础。方法：收集临床住院病人血清样本检测GPx活性，收集相应宫颈组织样本检测GPx活性及采用Western blot方法检测组织内SELENBP1蛋白表达水平，用Spearman等级相关来分析其相关性。结果：宫颈癌病人血清中GPx活性明显降低；与正常宫颈、CINⅢ级组织和相应癌旁组织相比，癌组织中GPx活性增强，SELENBP1蛋白表达也降低。结论：宫颈癌组织中SELENBP1表达水平与肿瘤组织微环境中GPx活性呈负相关，而与病人血清中GPx活性无关，提示SELENBP1可能是通过肿瘤微环境中GPx来发挥抗肿瘤作用。

[关键词]宫颈癌；硒结合蛋白1；谷胱甘肽过氧化物酶

近年来宫颈癌发病在我国有明显增高趋势，并趋于年轻化[1]，众多研究表明人体内必需微量元素的变化，影响着自由基形成和抗氧化剂的平衡状况，一旦失衡会损伤细胞导致疾病甚至引发恶性肿瘤[2,3]。人体内有两大类含必需微量元素硒的含硒蛋白(Selenoprotein)，其中研究最多、最普通的是以硒代半胱氨酸(Selenocysteine,Sec)形式广泛存在的谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)家族成员，其水平对体内硒有效性很敏感。另一类不含硒代半胱氨酸的是硒结合蛋白1(SELENBP1)，这两类含硒蛋白是被认为与癌症风险或发展有密切关系的[4]。硒是一种重要的、新型的、具有抗癌活性的微量营养元素，其抗癌作用是由SELENBP1介导的[5]，与蛋白结合才能发挥活性，通过谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)减轻过氧化氢、脂质及磷脂氢过氧化物的作用，进而抑制氧自由基和ROS的增殖[6]。但是SELENBP1的作用和具体机制还不清楚，这两种含硒蛋白在肿瘤发生发展中的关系也成为研究热点，本文主要在宫颈癌中研究这两种含硒蛋白的关系。

1材料与方法

1.1标本收集组织标本：收集湖北民族学院民大医院2014年5月至2015年2月妇科住院病人新鲜宫颈组织，其中子宫全切后正常宫颈(N)12例，子宫颈上皮内瘤变Ⅲ级(CINⅢ)15例，宫颈鳞癌(CA)及相应癌旁组织(pCA)标本各21例，每个组织样本分三部分，其中一部分超纯水反复清洗后制成10%组织匀浆，备用行GPx活性测定；另一部分做成直径约0.5 cm大小组织块，经10%中性福尔马林固定，常规脱水包埋，4 μm切片备用行常规染色及免疫组织化学染色(Immunohistochemical staining,IHC)观察；剩余组织冻存于-80℃冰箱备用。所有患者术前未做过放化疗、肿瘤药物治疗及微量元素补充。所有标本均有两位以上临床病理诊断医师确诊。

血清样本：上述所有研究对象在空腹8～12 h后于清晨取肘静脉血约5 ml，离心后取血清进行GPx活性测定，血清及组织中GPx活性测定方法按照试剂盒说明书操作。

1.2仪器与试剂离心机(德国eppendorf 5418 型)、721分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；BCA 法蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；SELENBP1 单抗(sc-373726)、内参β-actin(美国SANTA CRUZ 公司)；GPx活性测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；即用型小鼠免疫组化SABC法试剂盒及DAB显色试剂盒(DAB-kit)(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3组织样本检测方法各组宫颈组织中SELENBP1蛋白的表达：取-80℃保存的各组宫颈组织加入10倍体积的pH7.4的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中，用电动匀浆器制备组织匀浆，12 000 r/min、4℃离心20 min后，取上清进行蛋白定量后用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测表达情况，图像扫描和分析采用美国UVP公司凝胶成像系统及分析软件。

免疫组织化学染色(IHC)：采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化(SP)法检测，DAB显色，一抗SELENBP1的工作浓度为1∶400，操作流程按试剂说明书进行。SELENBP1表达以细胞浆和/或细胞核出现棕黄色颗粒为阳性。

2结果

2.1血清中GPx活性测定结果三组患者血清中GPx活性测定结果见表1，可见宫颈癌患者血清中GPx活性低于正常和CINⅢ组，差异有统计学意义(P<0.05)；正常和CINⅢ级患者血清中GPx活性无明显差别。

2.2宫颈组织中GPx活性测定结果由表2可看出宫颈癌组织中GPx活性明显增高(P<0.01)，癌旁组织、正常及CINⅢ级宫颈组织中酶活性无明显差异。

2.3宫颈组织中SELENBP1定位表达情况SELENBP1表达主要位于细胞核和细胞浆，统计结果显示宫颈癌组织中蛋白阳性表达率明显降低(P<0.01)，在正常组、CINⅢ组和癌旁宫颈组织之间表达无明显差异。见图1。

2.4宫颈组织中SELENBP1表达情况各组宫颈组织标本中SELENBP1表达情况见表3、图2，由统计分析结果可看出：宫颈癌组织中SELENBP1表达量低于癌旁组织、正常及CINⅢ级宫颈组织，差异有统计学意义(P<0.05)；而在后三组标本中蛋白表达量无统计学差异。

2.5相关性分析Spearman相关分析结果显示宫颈癌患者组织SELENBP1表达与组织中GPx活性呈负相关(r=-0.502，P=0.020)，而与患者血清中GPx活性无关(r=0.258，P=0.259)。癌旁组织中SELENBP1蛋白表达与GPx活性无关(r=-0.096，P=0.677)。

GroupNCINⅢCANo.121521GPx(nmol/ml)227.00±14.33215.93±15.54169.67±11.181)

Note：1)P<0.05 vs N，CINⅢ.

表2各组宫颈组织样本中GPx活性结果

GroupNCINⅢpCACANo.12152121GPx(nmol/mg.pro)20.33±1.3719.07±1.6719.24±1.8424.29±2.761)

Note：1)P<0.01 vs N，CINⅢ，pCA.

图1　宫颈组织中SELENBP1表达情况(IHC，×400)Fig.1　Expression of SELENBP1 in cervical tissues(IHC,×400)

表3SELENBP1在各组宫颈组织中的表达(IHC)

Tab.3Expression of SELENBP1 in cervical tissues (IHC)

GroupNo.Positive(n)Positive%N1212100CINⅢ151386.67pCA212095.24CA211361.901)

Note：1)P<0.01 vs N,CINⅢ,pCA.

图2　各组宫颈组织中SELENBP1表达情况 (WB法)Fig.2　Expression of SELENBP1 in cervical tissues (WB)Note: *.P<0.05 vs N,CINⅢ,pCA.

3讨论

SELENBP1是一种细胞溶质蛋白，是人体内硒元素的蛋白结合物，共价结合硒而介导细胞内硒的转运，位于染色体1q21-22，是由1721个核苷酸组成编码640个氨基酸，分子量为56 kD。宫颈癌时癌细胞会因各种原因产生大量活性氧(ROS)以逃避凋亡，也可引起癌细胞增殖、浸润、迁移及血管生成，但ROS过高也可致凋亡，因此ROS具有促癌和抗癌双重性[7，8]，与此同时需要体内强大的抗氧化功能来维持自身的氧化还原平衡状态，病理情况下需要体内多种抗氧化酶来清除过多的氧自由基，以保护组织和细胞免受损伤[9]，但是我们发现宫颈癌患者血清中GPx活性低于正常对照组，也有研究发现结肠癌患者血清GPx水平也明显降低[10,11]，可能是机体抗氧化体系在过多活性氧存在时受到破坏的结果。早期也有研究证实，与正常组织相比，肿瘤组织中清除氧自由基的抗氧化性蛋白质GPx过度表达[12]，因此肿瘤细胞才能够避免过多ROS所致的自身损伤。我们实验结果也表明宫颈癌组织中GPx活性明显高于癌旁组织，可能是由于肿瘤微环境中产生了大量ROS，从而导致GPx活性增强，但宫颈癌患者血清中GPx活性是明显降低，证明机体系统性抗氧化系统功能遭到破坏。因此这似乎有些矛盾，有学者分析认为这可能是在肿瘤发展的不同阶段同一种抗氧化酶在保护癌细胞及癌前病变细胞免受氧化性损伤过程中的作用机制是不同的[8]。

目前已知宫颈癌发病与HPV感染密切相关，而HPV感染的结局与机体免疫状态有很大关系，前期研究证实宫颈癌患者外周血中T细胞数量及CD4+T/CD8+T值显著低于正常，但在正常组和CINⅢ组之间无明显统计学差异，因此说明宫颈癌变后机体免疫功能明显下降[13]。HPV基因的表达不仅有利于病毒随着宿主上皮细胞分化复制，而且参加了逃避宿主免疫监视的机制，干扰机体免疫反应的途径，使机体检测不到病毒的存在，从而可能使微小病变得以逐步积累，经过多年发展成宫颈癌[14]，因此对早期宫颈病变的患者适当补硒有可能提高机体免疫系统清除HPV的能力，并抑制癌细胞的增殖，使宫颈病变患者的预后得以改善[15]，关于HPV感染与硒结合蛋白1之间的关系是我们正在研究的内容。

相关性分析显示宫颈癌组织中SELENBP1表达与GPx活性呈现明显负相关，而与宫颈癌患者血清中GPx活性无明显相关性，证明癌组织中SELENBP1表达水平与肿瘤微环境中抗氧化酶的活性有关，可能是血清中GPx活性可反映机体抗氧化体系功能，而肿瘤组织样本中代表的是硒长期蓄积暴露的结果，血清可用于检测短期暴露，肿瘤组织比其他生物标本更能代表长时期暴露，也更能准确反映肿瘤与微量元素的关系[16,17]，我们结果也证明了这点。关于SELENBP1与GPx之间的关系，在宫颈癌中鲜见报道，但在肝细胞癌[12]、前列腺癌[18,19]等中已证实二者存在明显负相关，可能机制是肿瘤微环境中增强的氧化应激被活化的GPx1削弱，进一步导致癌细胞存活、增殖、恶性转化、甚至转移[20]，也可能是GPx在细胞内的亚细胞定位分布影响了SELENBP1的水平[21]。总之硒结合蛋白1作为一种肿瘤抑制基因[4]，可用于预测多种癌症患者的预后，且与GPx有直接相互作用(Direct physical interaction)[19,22]。

但是SELENBP1抗癌机制尚不明确，在多种上皮来源恶性肿瘤中表达均降低，且与肿瘤患者预后明显相关，可能是参与了晚期高尔基体内蛋白质的转运，具有抑制细胞生长增殖的作用，还可能通过人缺氧诱导因子1α(HIF1α)促进肿瘤的进展[12,23]。在硒元素摄入量增加情况下，SELENBP1转录增高有利于机体对癌症的抵抗能力，可能通过抑制细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤的形成，其在宫颈癌中低表达甚至缺失与宫颈癌的发生发展密切相关，是肿瘤发生的早期事件，提示SELENBP1可成为判断宫颈癌患者临床预后的一项指标[24]。

总之，本研究表明SELENBP1可能作为肿瘤氧化还原微环境中的一种调节剂，通过GPx来发挥抑制肿瘤作用，可作为宫颈癌患者预后的一种肿瘤标志物，检测SELENBP1表达将有助于指导肿瘤个性化治疗。当然我们研究中存在很多不足，一是涉及的样本量少，二是SELENBP1通过何种机制来促进肿瘤发生发展，与体内ROS产生之间的关系等还知之甚少，因此需要进一步体内外研究证实。

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[收稿2015-07-25修回2015-08-07]

(编辑倪鹏)

Selenium binding protein 1 expression in cervical cancer tissues associated to antioxidant enzyme activity in tumor microenvironment

WANGFeng-Jie,WANGKe-Kun,CHENXian-Bing,LIUJin-Hong,LIUXin.

ScienceandTechnologyCollegeofHubeiUniversityforNationalities,Enshi445000,China

[Abstract]Objective:To investigate the correlation between the expression of Selenium Binding Protein 1(SBP1,SELENBP1) and Glutathione peroxidase (GPx) activity in cervical cancer tissues and provide theoretical basis in the development of cervical cancer for SELENBP1.Methods: The expression of SELENBP1 was detected by Western blot in normal cervical tissues,intraepithelial neoplasia (CIN)Ⅲ,cervical cancer (CA) and related adjacent cancer (pCA) tissues,and GPx activity in serum and tissues using a spectrophotometric assay according to the instructions.Results: The GPx activity in serum of patients with cervical cancer was significantly decreased;compared with normal cervix,CINⅢ and corresponding adjacent tissues groups,GPX activity was increased,and the expression of SELENBP1 was decreased in cancer tissues.Conclusion: The role of SELENBP1 in cervical cancer development and prognosis,which can play an anticancer role through GPx in tumor microenvironment.

[Key words]Cervical cancer;SELENBP1;GPx

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.024

作者简介：王凤杰(1981年-)，女，硕士，讲师，主要从事妇科肿瘤病理研究。

中图分类号R373.33

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0711-04

①本文为湖北省教育厅科学技术研究项目(D20131904)；湖北民族学院科技学院科研项目(KY201410)。

②恩施州疾病预防控制中心，恩施445000。

③湖北民族学院医学院，恩施445000。

④湖北民族学院附属民大医院病理科，恩施445000。

通讯作者及指导教师：陈显兵(1976年-)，男，硕士，副教授，主要从事妇科肿瘤病理方面研究。