牟　娜　樊秀红　郭连峰　李　宁　曾瑞红

(河北衡水哈励逊国际和平医院，衡水053000)



模式识别受体TLR3、RIG-I和MDA5在慢性乙肝患者外周血的表达水平①

牟娜樊秀红②郭连峰李宁曾瑞红③

(河北衡水哈励逊国际和平医院，衡水053000)

[摘要]目的：观察慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血中单个核细胞胞膜和胞质模式识别受体mRNA的表达表达水平。方法：54例慢性乙型肝炎患者为实验组， 40例健康体检者为对照组。采集实验组和对照组的新鲜空腹抗凝血，分离单个核细胞，提取单个核细胞中RNA，并反转录为cDNA，应用实时定量PCR技术检测Toll样受体3(TLR3)、维甲酸诱导基因-I(RIG-I)、黑色素瘤分化相关分子5(MDA5)、I型干扰素(IFN-α、IFN-β)、转录因子3(IRF-3)mRNA表达水平。结果：与正常对照组比较，实验组的TLR3、RIG-I、MDA5、IFN-α、IFN-β、IRF-3 mRNA表达水平均明显降低，具有显著性差异(P<0.05)。高病毒载量组中的各分子表达水平与低病毒载量组和健康对照组比较降低更明显，且TLR3、RIG-I、MDA5、IFN-α、IFN-β、IRF-3 mRNA水平分别与HBV-DNA的含量呈负相关(r=-0.697、-0.738、-0.867、-0.618、-0.415、-0.573)。结论：细胞胞膜(TLR3)和胞质(RIG-1、MDA5)模式识别受体、IFN-α、IFN-β、IRF-3 mRNA水平在慢性乙型肝炎患者的外周血单个核细胞中的表达降低，可能与HBV感染的慢性化状态有关。

[关键词]慢性乙型肝炎；TLR3；RIG-1；MDA5；IFN-α；IFN-β；IRF-3

目前全世界约有3.5亿慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染者，约占全球人口的6%，我国作为乙肝的多发流行区，约占全球HBV表面抗原总携带率的50%，且60%的人受过HBV的感染[1]。慢性乙型肝炎是由HBV感染而致病的炎症性疾病，感染持续半年以上，表现为持续性感染。乙型肝炎的治疗最终取决于宿主免疫系统与病毒毒力之间的力量对比。天然免疫是机体抵抗病毒感染的重要防线，在抵抗乙型肝炎病毒感染时同样发挥着重要的作用[2]。

天然免疫系统要依赖识别受体模式识别入侵的外源病原微生物，然后将其清除掉。哺乳动物主要具有两类微生物识别系统,一类是膜结合受体,如Toll样受体(Toll like receptors,TLR)[3],存在于细胞膜和细胞器室膜上，识别胞外微生物,然后活化细胞内信号激发机体的免疫反应;另一类是细胞质中的模式识别受体,包括具有螺旋酶结构域的抗病毒蛋白视黄酸(维甲酸)诱导基因蛋白I (Retinoic acid inducible gene,RIG-1)和黑色素瘤分化相关抗原5 (Melanoma differentiation-associated gene5,MDA5)，在病毒感染过程中，这些分子均可识别病毒的RNA，在机体抗病毒的免疫应答中发挥着十分重要的作用。本研究旨在考察两类模式识别受体(TLR3、RIG-1、MDA5)和I型干扰素在慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞的表达情况。为探索慢性乙肝的致病机制提供新的理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1临床资料收集2012年11月至2014年1月之间来河北省衡水市哈励逊国际和平医院就诊的慢性乙型肝炎患者54例为实验组，其中男32例，女22例。年龄18～64岁;平均年龄(38.8±10.7)岁。诊断均符合《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准[4]。另同期收集40例排除慢性乙型肝炎等多种疾病的健康人为实验对照组，其中男性26例，女性14例；年龄21～59岁，平均年龄(36.7±9.8)岁。两组在性别、年龄的差异无统计学意义。本研究得到我院伦理委员会批准并取得所有受试者的知情同意。

1.1.2实验仪器和试剂

1.1.2.1主要试剂淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)。Total RNA提取试剂[宝生物工程(大连)有限公司]；PCR反应体系(康为世纪公司)；PCR引物[英潍捷基(上海)有限责任公司]；DEPC水(美国Promega公司)。ELISA试剂盒(北京欣博盛生物科技有限公司)。

1.1.2.2主要仪器荧光定量PCR仪[上海宏石医疗科技有限公司(SLAN)]；生物安全柜[济南市鑫贝西生物技术有限公司(BSC-1100ⅡB3)]；酶标仪[芬兰Labsystem Dragon公司(Wellscan MK2)]；恒温水浴箱[北京市永光明医疗仪器厂(DHP-600)]；干式恒温器[江苏省海门其林贝尔仪器制造公司(GL-150B)]；低温超速离心机[珠海黑马医疗器械公司(TGL-16R)]。

1.2实验方法

1.2.1标本采集在实验组与对照组人员空腹的状态下各采集全血8 ml，其中2 ml加入到干管中使血清自然析出，用来检测生化指标和干扰素的蛋白质含量；剩余的6 ml则平均加到两个肝素抗凝管中，每管3 ml，马上对其进行单个核细胞的分离。把分离好的单个核细胞和收集好的血清分别进行编号、记录后，保存于-80℃的低温冰箱中备用。

1.2.2提取RNA按照Trizol说明书提取实验组和对照组的单个核细胞，加入Trizol试剂使细胞充分溶解，得到匀浆裂解液放-80℃低温冰柜保存，以备集中提取RNA。在裂解液中加入1/5体积量的氯仿，剧烈震荡充分乳化。12 000 r/min，4℃离心15 min，吸取上清液，加入1 ml的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，室温静置10 min。12 000 r/min，4℃离心10 min。得到总RNA。75%的DEPC酒精1 ml洗涤RNA，在用DEPC水溶解RNA。

1.2.3反转录将1 μl的 Oligo(dT)18 primer，3 μl 的已提取的RNA，8 μl 的Water,nuclease-free，总共为12 μl，混匀，置于65℃干热恒温器上，5 min。然后加入4 μl 的5×Buffer，1 μl的RiboLock Rnase inhibitor(20 U/μl),2 μl的Mm dNTP Mix和1 μl的RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase(200 U/μl)，点动离心，置于42℃水浴箱，1 h；最后放在干热恒温器上，将其调至70℃，5 min。

1.2.4PCR反应体系和流程体系：2×UltraSYBR Mixture(With ROX)25 μl+ Forward Primer (10 μmol/L) 1.0 μl+ Reverse Primer (10 μmol/L)1.0 μl + cDNA 1.0 μl + RNase-Free Water 22 μl；流程： 预变性：95℃,10 min→变性:95℃,15 s→退火/延伸：60℃,1 min。共40个循环。扩增后通过凝胶成像，经全自动凝胶成像分析仪扫描DNA条带灰度值，软件分析条带灰度比值。

1.2.5计算方法计算方法:mRNA 的相对表达量以2-△△CT表示[5]①实验组测定CT值减去其内参的CT值，得到△CT1。②正常对照组CT值减去其对应内参CT值，得到△CT2，从△CT2找出一个适中的数值做标准△CT。③实验组△CT1减去标准△CT，得到△△CT1，计算出2-△△CT1。④正常对照组△CT2减去标准△CT，得到△△CT2，计算出2-△△CT2。进行统计分析。

1.2.6血清HBV DNA检测所有标本均在室内质量控制合格的条件下进行检测。采用PCR结合荧光探针的体外DNA扩增和检测技术定量检测DNA含量。根据患者HBV拷贝数分为高病毒载量(>105copies/ml)和低病毒载量(<105copies/ml)。血清IFN-α和IFN-β蛋白检测：采用ELISA试剂盒，严格按照说明书进行操作，测出的标准曲线,其相关系数均在0.99以上。

2结果

2.1外周血单个核细胞中TLR3、RIG-1、MDA5 、IFN-α、IFN-β、IRF-3 mRNA的表达情况实验组的TLR3、RIG-1、MDA5 、IFN-α、IFN-β、IRF-3 mRNA水平与健康对照组比较均降低。高病毒载量组与低病毒载量组比较，高病毒载量组均比低病毒载量组降低。见表1。

2.2各组PBMC中TLR3、RIG-1、MDA5 mRNA的表达高病毒载量组和低病毒载量组的TLR3、RIG-1、MDA5 mRNA 表达水平显著低于健康对照组，且高病毒载量组进一步低于低病毒载量组。见图1。

2.3病毒载量和mRNA的相关性分析实验组的TLR3、RIG-1、MDA5、 IFN-α、IFN-β和IRF-3 mRNA水平，分别与HBV-DNA的含量(log copies/ml)呈负相关(r=-0.697、-0.738、-0.867、-0.618、-0.415、-0.573)具有显著性差异，P<0.05。见图2。

图1　RT-PCR检测TLR3、RIG-1、MDA5 mRNA的表达Fig.1　TLR3，RIG-1，MDA5 mRNA expression detected by RT-PCRNote: 1.NC group；2 .Low virus load group；3.High virus load group.

GroupTLR3RIG-1MDA5IRF-3IFN-αIFN-βNCgroup(n=40)22.76±10.7829.01±8.9125.4±11.9833.16±14.1443.16±18.3439.16±18.17Lowvirusload(n=30)11.31±3.291)18.26±7.201)13.75±5.091)18.35±4.651)23.79±18.921)20.25±18.631)Highvirusload(n=24)6.34±3.052)9.40±4.992)6.68±3.242)12.37±6.552)18.35±8.632)12.88±6.052)

Note：1)P<0.05 compared with NC group;2)P<0.05 compared with Low virus load.

图2　病毒载量和TLR3、RIG-1、MDA5、 IFN-α、IFN-β和IRF-3 mRNA的相关性分析Fig.2　Correlation analysis among HBV-DNA and TLR3，RIG-1，MDA5， IFN-α，IFN-β，IRF-3 mRNA in all patients with CHB

图3　用酶联免疫法检测的的血清中IFN-α、IFN-β的蛋白质水平Fig.3　Protein level of IFN-α and IFN-β in serum by ELISANote: P<0.05.

2.4干扰素的蛋白水平

2.4.1IFN-α的蛋白含量IFN-α的蛋白含量在慢性乙型肝炎患者中的表达降低，实验组蛋白质的平均测定浓度为22.76 pg/ml，SD为4.71。而正常对照组的平均测定浓度为145 pg/ml，SD为20.01。实验组平均值比正常对照组平均值低6.37倍，表达水平明显降低。两组数据使用统计软件进行统计，t=3.264,P<0.05，具有统计学意义。见图3。

2.4.2IFN-β的蛋白含量IFN-β的实验组蛋白平均测定浓度为3.96 pg/ml，SD为1.57，正常实验对照组平均浓度为31.34 pg/ml，SD为3.62，IFN-β蛋白质水平在慢性乙肝患者体内表达明显降低。两组数据应用SPSS13.0统计软件进行统计，t=4.023,P<0.05，具有统计学意义。见图3。

3讨论

乙型肝炎病毒(HBV)是一种隐形病毒，侵染肝细胞后，能够干扰肝细胞正常的新陈代谢，如HBV破坏肝细胞的线粒体，HBV在肝细胞内增殖活跃进而造成肝细胞破损，呈现慢性炎症急性发作或慢性炎症持续存在的表现[6]。

到目前为止，人类已发现的Toll样受体(TLR)有13种[7]，分别命名为TLR1-TLR13，TLR可通过识别病原相关的分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)，引发信号转导，导致炎症介质的释放，在天然免疫防御中起重要作用，并最终激活获得性免疫系统，是连接天然免疫和获得性免疫的重要桥梁。其中只有TLR 3与病毒感染有关，是通过IRF3信号通路分泌干扰素的[8]。

RIG-I和MDA5属于同源 RNA 螺旋酶，均可识别病毒来源的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)，并且具有识别不同病毒入侵的功能[9]。MDA5和 RIG-I是两个细胞浆内极其重要的抗病毒分子,可识别病毒相关的分子模式，从而介导机体抗病毒天然免疫应答[10]。当病毒感染时，细胞内大量产生dsRNA ,MDA5和 RIG-I均可以通过识别dsRNA 进而激活 NF-κB 和干扰素调节因子3(Interferon regulatory Factor 3,IRF3)[11],从而诱导具有抗病毒作用Ⅰ型干扰素的生成。IRF-3存在于细胞质溶胶中，是调节Ⅰ型干扰素(IFN-α和IFN-β)产生的最重要的转录因子，且它能有效激活IFN-α和IFN-β基因[12]，干扰素具有广谱抗病毒和免疫调节两方面的作用，可抑制病毒DNA复制和RNA合成，促进病毒RNA降解，抑制病毒蛋白的合成和转运及病毒颗粒的成熟和分泌等[13]。因此RIG-I和MDA5也能激活Ⅰ型干扰素的合成。与Toll样受体不同，RIG样螺旋体是胞质可溶性蛋白，可以直接或间接识别进入细胞内的病原体及其产物，RIG-I信号通路的活化能够促进干扰素的产生，而干扰素又能够进一步的促进RIG-I的表达，从而形成一个正反馈过程[14]。考虑到病毒生活史的大部分时间均发生于细胞浆内[15]，因此胞质模式识别受体在启动病毒感染诱发的Ⅰ型干扰素诱生中可能发挥重要作用。

本研究结果发现，慢性乙肝患者外周血单个核细胞中模式识别受体(TLR3、MDA5、RIG-I)、IFN-α、IFN-β和IRF-3 mRNA 水平均降低，且均明显低于健康对照组(P<0.05)。高病毒载量组又低于低病毒载量，具有统计学意义(P<0.05)。高病毒载量患者体内的数值明显低于低病毒载量患者，可能是因为HBV抑制了模式识别受体的作用，导致HBV逃逸机体的天然免疫，这可能是HBV感染慢性化的发病机制之一。与赵钢德等[16]研究结果一致。TLR3 mRNA低表达可能是由于乙肝病毒侵入机体后，其DNA整合到宿主肝细胞内，不表达或是低表达PAMPs，抑制机体的TLR3的表达，使其不能发挥作用，不能清除或是不能完全清除乙肝病毒。与周兰英等[17]的报道基本一致。实验组的TLR3、RIG-1、MDA5、IFN-α、IFN-β和IRF-3 mRNA水平，分别与HBV-DNA的含量呈负相关具有显著性差异，P<0.05。

我们考察了干扰素在血清中的蛋白表达的水平情况，实验组和正常对照组中的水平与其mRNA 水平一致，表明mRNA的表达水平具有代表性；结果提示模式识别受体可能在乙肝炎症发展中发挥着重要作用，调节模式识别受体的水平可能成为乙型肝炎治疗的一条新途径。

目前病毒性肝炎抗病毒治疗的主要措施就是使用干扰素，胞膜和胞质模式识别受体在抗HBV感染的固有免疫应答中发挥着重要作用，因此，针对PRRs信号通路中某些环节进行干预，调节PRRs表达水平控制HBV感染，可能成为新的抗病毒策略。同时，一些新信号的转导机制的发现可能为我们提供治疗靶点。

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[收稿2015-07-04修回2015-07-20]

(编辑许四平)

Expression level of pattern recognition receptors TLR3,RIG-I and MDA5 in peripheral blood of patients with chronic hepatitis B

MUNa，FANXiu-Hong,GUOLian-Feng,LINing,ZENGRui-Hong.

ClinicalLabratoryDepartment,HarrisonIntornationalPeaceHospital,Hengshui053000,China

[Abstract]Objective:To investigate the expression of the PRRs in the cytomembrane and cytoplasm in the peripheral blood of patients with CHB.Methods: 54 patients with the CHB were the experimental group，while 40 healthy persons served as the control group.Anti-coagulant fresh blood on an empty stomach was drawed from both experimental groups and control group.The mononuclear cells were separated.RNA of mononuclear cells was extracted and reverse transcribed into cDNA.The relative mRNA expression of TLR3,RIG-I,MDA5,IFN-α,IFN-β and IRF-3 was detected with real-time quantitative PCR.Results: The relative mRNA expression of TLR3,RIG-1,MDA5,IFN-α,IFN-β and IRF-3 of the two experimental groups were significantly lower than that in control group (P<0.05).The relative mRNA levels of these moleculars in the experimental group with high virus load was lower significantly than those in the experimental group with low virus load .The levels of TLR3，RIG-I，MDA5，IFN-α，IFN-β，IRF-3 expression have negative correlation to loads of HBV(r=-0.697，-0.738，-0.867，-0.618，-0.415，-0.573).Conclusion: The mRNA expression levels of the PRRs (TLR3,RIG-1 and MDA5) in the peripheral blood mononuclear cells of the patients with CHB were significantly decreased.May be associated with chronic HBV infection status.

[Key words]Chronic hepatitis B;TLR3;RIG-1；MDA5;IFN-α；IFN-β；IRF-3

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.025

作者简介：牟娜(1982年-)，女，硕士，主要从事HBV感染和免疫方面研究。通讯作者及指导教师：曾瑞红(1970年-)，女，硕士生导师，教授，主要从事基础免疫学研究，E-mail:zengruihong1970@sina.com。

中图分类号R392.12

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0715-05

①本文为河北省应用基础研究计划重点基础研究资助项目(12966117D)。

②衡水市景县人民医院，衡水053000。

③河北医科大学免疫教研组，石家庄050000。