丁海霞　赵连梅　崔雯萱　丁　娟　单保恩

(河北医科大学第四医院肿瘤研究中心，石家庄050000)



CCL5在胃癌患者肿瘤组织和血清中的表达及临床意义①

丁海霞赵连梅崔雯萱丁娟单保恩

(河北医科大学第四医院肿瘤研究中心，石家庄050000)

[摘要]目的：检测胃癌患者组织及血清中的CCL5的表达并探讨血清中CCL5表达的临床意义。方法：选择临床病理资料齐全的胃癌蜡块标本48例，取癌组织和癌旁组织(对照组)，采用SP免疫组化法检测CCL5在胃癌组织及癌旁组织中的表达。抽取新诊断胃癌患者50例(均未行手术及放化疗)及健康志愿者16例(对照组)的血清标本，采用ELISA检测CCL5在胃癌患者及健康志愿者血清中的表达，研究血清中CCL5的表达水平与胃癌的病理因素及生物学行为之间的关系。结果：CCL5在胃癌患者组织及血清中呈高表达，与对照组相比，明显升高，具有统计学差异(P<0.001)，胃癌患者血清中CCL5的表达水平与胃癌组织浸润深度、淋巴结转移情况、TNM分期情况及肿瘤分化程度均具有相关性(P<0.001)，与患者的性别及年龄无相关性。结论：CCL5 可能成为胃癌患者肿瘤分期及疾病进展的重要分子标志。

[关键词]胃癌；CCL5：肿瘤组织；血清

胃癌是世界上导致肿瘤相关死亡的第二大疾病，是消化道最常见的恶性肿瘤之一，生长迅速，晚期预后差，肿瘤的浸润深度及淋巴结转移情况与患者的预后密切相关，肿瘤生物学行为及预后的正确判断对病人选择最佳的治疗方案至关重要[1]。肿瘤的生长、侵袭和转移依赖于宿主细胞和肿瘤的复杂的相互作用，而趋化因子在肿瘤与宿主细胞的相互作用中扮演了重要的角色，趋化因子家族包含大量的具有趋化作用的低分子量蛋白，以趋化粒细胞迁移到炎症部位。趋化因子家族按结构分为四大类：C、CC、CXC、CX3C，至今已鉴别出50多种不同的趋化因子，大部分是CC和CXC家族成员。CC类趋化因子吸引单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞和自然杀伤细胞到达炎症部位，但能否趋化中性粒细胞尚无定论[2]。

趋化因子配体5(CCL5/RANTES)属于CC类趋化因子家族，其受体有CCR1、CCR3和 CCR5[2]。CCL5在肿瘤和炎性疾病中发挥重要作用，最近的研究发现乳腺癌病人中CCL5的表达与疾病进展直接相关[3-8]，另外，在宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌和黑色素瘤患者的组织和血清中CCL5的表达与疾病进展具有相关性[8-10]。目前对CCL5的表达与胃癌的关系研究极少[11-14]。在本研究中我们对比了CCL5在胃癌组织和癌旁组织及胃癌患者和健康志愿者血清中的表达差异，并对胃癌患者血清中CCL5的表达与胃癌的病理因素及生物学行为之间的关系进行分析，试图为临床判断胃癌分期及疾病进展提供重要的分子生物学指标。

1资料与方法

1.1一般资料胃癌组织取材于河北医科大学第四医院2013年住院的48例胃癌患者，其中男28例，女20例，年龄50～75岁，术前均未行放化疗及其他抗肿瘤治疗。胃癌患者50例，女24例，男26例；年龄34～82岁，中位年龄54.5岁，收集于2013年10月～2014年3月就诊于河北医科大学第四医院外三科的患者，经术后病理组织学明确诊断为胃癌，之前未经过放、化疗及生物治疗，无合并其他疾病的胃癌患者。所有患者术后均依照美国癌症联合委员会(AJCC)制定的胃癌TNM分期第七版标准记录病理类型、临床分期及分化类型。健康对照组16例，女9例 ，男7例；年龄25～80岁， 中位年龄 52.5岁。均为河北医科大学第四医院经健康体检中心体检合格的健康人。

1.2主要的试剂及仪器CCL5兔抗人单克隆抗体购自上海拜力生物科技有限公司，SP免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒均购自中杉金桥科技公司。人调节激活正常T-细胞表达分泌因子(RANTES)检测试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司)。450 nm酶标仪(美国雷杜RT-6000)。

1.3方法胃癌组织及癌旁组织切片后常规HE染色，确定标本的组织分化程度，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)免疫组织化学法检测CCL5在胃癌组织和癌旁组织中的表达水平。石蜡切片，常规脱蜡、水化组织切片，采用枸橼酸盐缓冲液煮沸热修复30 min后冷却至室温，3%H2O237℃孵育10 min，PBS冲洗2×3 min；1∶100滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗2×3 min；滴加二抗,37℃30 min,PBS冲洗2×3 min;DAB显色，自来水充分冲洗后，常规脱水，透明，干燥，封片。

结果判定：依照细胞阳性着色程度(抗原含量)，可分为：弱阳性(+)┅1分；中等阳性(++)┅2分；强阳性(+++)┅3分。依照阳性细胞数量，可分为：弱阳性(+)，指阳性细胞总数在25%以下；中等阳性(++),指阳性细胞总数在25%～49%；强阳性(+++ )，指阳性细胞总数在50%以上)。 目前多采用积分综合计量。计算公式为：(+)%x1 +(++)%x2+(+++)%x3；总数值<1.0者为(+)记为1分，1.0～1.5者为(++)记为2分,>1.5者为(+++)记为3分，表达阴性者记为0分。至少随机观察5～10个HPF。

手术前抽取经胃镜证实为胃癌的患者血液标本3 ml，室温放置4 h，然后1 409 r/min离心20 min，取上清置于-80度保存，同时收集健康志愿者等量血液离心后冻存，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法检测血清中CCL5的含量。试验前将所有试剂和标本缓慢均衡至室温，加样后37℃孵育2 h，弃去液体，甩干，不用洗涤，加入检测液A 100 μl，37℃孵育1 h，洗板3次后加入检测液B 100 μl，37℃孵育0.5 h，洗板5次，37℃避光显色20 min后加入终止液，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)，制作标准曲线，根据标准曲线的回归方程式计算出血清中CCL5的含量。

1.4统计学方法应用SPSS13.0软件进行统计学处理，CCL5在癌和癌旁组织的表达差异应用病理评分量化后采用配对设计的t检验，CCL5在胃癌及健康志愿者中的表达差异及与临床病理特征的关系研究应用参数及非参数检验，P<0.01为差异有统计学意义。

2结果

2.1CCL5在胃癌患者组织中的表达根据胃癌组织间质中巨噬细胞阳性着色程度和细胞数量进行积分统计，总数值<1.0者为(+)记为1分，1.0～1.5者为(++)记为2分,>1.5者为(+++)记为3分，表达阴性者记为0分，见图1，两者统计比较发现胃癌组织中CCL5表达水平明显高于癌旁组织(P<0.001)，见表1。

2.2CCL5在胃癌患者血清中的表达胃癌患者血清中CCL5的表达量为(7.07±2.02) ng/ml，明显高于健康对照组(1.97±0.22 )ng/ml (P<0.001)，见表2和图2。

2.3胃癌患者血清中CCL5的表达与胃癌病理因素的关系胃癌患者血清中CCL5的表达水平在患者的年龄及性别比较中无明显差别(P>0.05)，反之，在肿瘤大小、浸润越深、分化程度、淋巴结转移情况、瘤栓形成、病理分期方面的比较中有统计学差异(P<0.01)，即肿瘤越大、浸润越深、分化程度越低、分期越晚、伴淋巴结转移和瘤栓形成的患者其血清中CCL5的表达水平越高。具有统计学差异(P<0.01)，见表3。

图1　CCL5在胃癌组织及癌旁组织中的表达情况(SP，×200)Fig.1　Expression of CCL5 in gastric cancer and precancerous tissues(SP，×200)Note: A.Precancerous tissues,pathological score=0;B.Gastric cancer,pathological score=1;C.Gastric cancer,pathological score=2;D.Gastric cancer,pathological score=3.The arrows show positive particles in cytoplasm of macrophage.

表1CCL5在胃癌组织及癌旁组织中的表达水平比较

Tab.1Expression of CCL5 in gastric cancer and adjacent tissues

GroupsExpressionofCCL5(n)-++++++PCancer0101721<0.0001Adjacentcancer44400

表2CCL5在胃癌患者及对照组血清中表达水平比较

Tab.2Comparison of serum level of CCL5 in gastric cancer group and control group

Groupsn(ng/ml)PvalveGastricancergroup507.07±2.02<0.001Controlgroup161.97±0.22

图2　CCL5在胃癌患者及对照组血清中表达水平比较Fig.2　Comparison of serum level of CCL5 in gastric cancer group and control group

表3血清CCL5表达水平与胃癌病理因素的关系

Tab.3Relationship between expression of serum CCL5 levels and pathological factors of gastric cancer

FeaturenThelevelofCCL5(ng/ml)PAge(year)>0.01≤65227.75±1.69>65286.54±2.12Gender>0.01Male267.35±1.45Female247.05±1.87Tumorsize(cm)<0.01≤5236.05±1.31>5277.54±1.35Invasiondepth<0.01T1+T2256.24±1.42T3+T4257.48±1.38Degreeofdifferentiation<0.001High196.18±1.23Low318.47±1.33Lymphnodemetastasis<0.001No216.24±1.26Yes298.52±1.31Pathologicalgrade<0.01Ⅰ-Ⅱ276.08±1.32Ⅲ-Ⅳ237.35±1.35Tumorthrombus<0.01No206.28±1.28Yes307.42±1.23Envelop<0.01Without116.06±1.55With397.37±1.16

3讨论

肿瘤的生长、浸润和转移依赖于肿瘤和宿主细胞之间复杂的相互作用关系，而趋化因子在肿瘤向宿主远处器官的转移中发挥重要作用[15-17]。CCL5作为趋化因子家族的一员参与肿瘤和炎症的发生[2-4]，已有报道CCL5在胃癌前病变患者及胃炎患者血清中无高表达[16]，而其在胃癌中的表达的研究相对较少[17-20]，我们的研究中对胃癌组织和癌旁组织及胃癌患者和健康对照者的血清CCL5的表达水平进行了检测，从而了解趋化因子与胃癌的关系，分析其与肿瘤的病理特征及生物学行为的关系。

我们的研究发现，CCL5在胃癌组织中呈高表达，与癌旁组织相比具有统计学意义，与健康对照组相比，胃癌患者血清中CCL5的表达水平明显升高，CCL5的高水平表达与患者年龄及性别无关，肿瘤体积越大、浸润越深、分化越低、病理分期越晚、伴有瘤栓形成及淋巴结及远处转移的患者血清中CCL5的水平越高，说明CCL5与胃癌的生长、分化、病理分期及侵袭、转移密切相关。

CCL5主要表达于T淋巴细胞、巨噬细胞、血小板、滑膜成纤维细胞、肾小管上皮细胞和一定类型的肿瘤细胞[19]。 NF-κB通路的激活诱导CCL5的产生。CCL5可以招募大量的粒细胞到达炎症部位，包括T细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞，同时对由T细胞分泌的细胞因子如IL-2、IFN-γ也有趋化作用。CCL5也可以使特殊的自然杀伤细胞激活和增殖从而产生CC趋化-激活杀伤细胞[19]，由CD8+T细胞和其他免疫细胞产生的CCL5表现出抑制HIV进入靶细胞的能力。CCL5主要通过其受体发挥作用，目前发现的受体有CCR1、CCR3和 CCR5，而CCR5是最主要的[19]，CCL5/CCR5的相互作用导致胃癌肿瘤发生、发展主要有以下几种方式：作为生长因子促进血管发生；调节细胞外基质，包括招募其他的基质细胞和炎细胞；参与免疫逃逸机制[20]。因此以CCL5/CCR5轴为靶点的治疗已经在乳腺癌患者中得到应用，在其他肿瘤治疗中的应用尚待进一步研究[21]。

总之，血清CCL5水平可能成为胃癌患者肿瘤行为及预后的重要分子标志，我们将进一步对其受体及CCL5的基因多态性进行研究，从而为胃癌的分子靶向药物治疗提供新的靶点。

参考文献：

[1]Schall TJ,Bacon KB.Chemokines,leukocyte trafficking,and inflammation [J].Curr Opin Immunol,1994,6(6):865-873.

[2]Singh S,Sadanandam A,Singh R,etal.Chemokines in tumor angiogenesis and metastasis[J].Cancer Metastasis Rev,2007,26(3-4):453-467.

[3]Luboshits G,Shina S,Kaplan O,etal.Elevated expression of the CC chemokine regulated on activation,normal T cell expressed and secreted (RANTES) in advanced breast carcinoma[J].Cancer Res,1999,59(18):4681-4687.

[4]Azenshtein E,Luboshits G,Shina S,etal.The CC chemokine RANTES in breast carcinoma progression:regulation of expression and potential mechanisms of promalignant activity[J].Cancer Res，2002,62(4):1093-1102.

[5]Robinson SC,Scott KA,Wilson JL,etal.A chemokine receptor antagonist inhibits experimentalbreast tumor growth[J].Cancer Res，2003,63(23):8360-8365.

[6]Eissa SA,Zaki SA,El-Maghraby SM,etal.Importance of serum IL-18 and RANTES as markers for breast carcinoma progression[J].Egypt Nat Cancer Inst,2005,17(1):51-55.

[7]Yaal-Hahoshen N,Shina S,Leider-Trejo L,etal.The chemokine CCL5 as a potential prognostic factor predicting disease progression in stage II breast cancer patients[J].Clin Cancer Res,2006,12(15):4474-4478.

[8]Niwa Y,Akamatsu H,Niwa H.Correlation of tissue and plasma RANTES levels with disease course in patientswith breast or cervical cancer[J].Clin Cancer Res,2001,7(2):285-289.

[9]Tsukishiro S,Suzumori N,Nishikawa H.Elevated serum RANTES levels in patients with ovarian cancer correlate with the extent of the disorder[J].Gynecol Oncol,2006,102(3):542-545.

[10]Kwon KH，Lee YC，Chung JH，etal.Association study of chemokine(C-C motif)ligand 5 gene polymorphism and papillarythyroid Cancer[J].Invest Surg，2013,26(6):319-324.

[11]Kim HK,Song KS,Park YS,etal.Elevated levels of circulating platelet micro particles.VEGF,IL-6 and RANTES in patients with gastric cancer:possible role of ametastasis predictor[J].Eur J Cancer,2003,39(2):184-191.

[12]Okita K,Furuhata T,Kimura Y,etal.The interplay between gastric cancer cell lines and PBMCs mediated by the CC chemokine RANTES plays an important role in tumor progression[J].Exp Clin Cancer Res,2005,24(3):439-446.

[13]Sugasawa H,Ichikura T,Tsujimoto H,etal.Prognostic significance of expression of CCL5/RANTES receptors in patients with gastric cancer[J].Surg Oncol,2008,97(5):445.

[14]Sugasawa H,Ichikura T,Kinoshita M,etal.Gastric cancer cells exploit CD4+cell-derived CCL5 for their growth and prevention of CD8+cell-involved tumor eli mination[J].Int J Cancer,2008,122(11):2535-2541.

[15]Balkwill F.Chemokine biology in cancer[J].Se min Immunol,2007,15(1):49-55.

[16]Sima AR,Sima HR,Rafatpanah H,etal.Serum chemokine legend 5(RANTES)level might be utilized as a predictive marker of tumor behavior and disease prognosis in patients with gastric adenocarcinoma[J].J Gastrointest Cancer,2014,45:476-480.

[17]Muller A,Homey B,Soto H,etal.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J].Nat,2001,410(6824):50-56.

[18]Murphy P.Chemokines and the molecular basis of cancer metastasis[J].N Engl J Med,2001,345(11):833-835.

[19]Soria G,Ben-Baruch A.The inflammatory chemokines CCL2 and CCL5 in breast cancer[J].Cancer Lett,2008,267(2):271-285.

[20]Kershaw MH,Westwood JA,Darcy PK.Geneengineered T cells for cancer therapy[J].Nat Rev Cancer,2013,13,(8):525-541.

[21]Lv D,Zhang Y,Kim HJ,etal.CCL5 as a potential immunotherapeutic target in triple-negative breast cancer[J].Cell Mol Immunol,2013,10(4):303-310.

[收稿2015-04-01修回2015-07-20]

(编辑倪鹏)

Expression and clinical significance of CCL5 in tumor tissues and serum of patients with gastric cancer

DINGHai-Xia,ZHAOLian-Mei,CUIWen-Xuan，DINGJuan，SHANBao-En.

DepartmentoftheInstituteofCancerResearch,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China

[Abstract]Objective:In order to detect the expression of CCL5 in tissue and serum of patients with gastric carcinoma and to explore the clinical significance of expression of CCL5 in serum.Methods: 48 cases patients with completed clinical and pathological data of gastric cancer paraffin block specimens were selected.Cancer and paracan-cerous tissues were used as control,using SP immunohistochemical method to detect CCL5 in gastric cancer tissues and adjacent tissues.Serum specimens were extracted from 50 cases of newly diagnosed patients with gastric cancer (from none underwent operation and chemotherapy) and 16 healthy volunteers,ELISA was used to detect the expression of CCL5 in gastric cancer patients and healthy volunteers in the serum,the differences between the expression of gastric cancer patients and healthy volunteers,and the relationship between pathologicalfactors and biological behavior of gastric cancer and expression of CCL5 were studied.Results: The high expression of CCL5 in tissue and serum of gastric cancer patients,compared with control group,increased significantly,with statistical difference (P<0.001).The expression of CCL5 and gastric cancer invasion depth,lymph node metastasis, TNM staging and tumor differentiation were correlated (P<0.001),no correlation with gender and age of patients.Conclusion: CCL5 may be the importantmolecular marker in patients with gastric cancer staging and signs of the disease.

[Key words]Ganstric cancer;CCL5；Tumor tissues；Serum

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.023

作者简介：丁海霞(1981年-)，女，硕士，主要从事内分泌与免疫机制方面研究。

中图分类号R735.2

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0707-04

①本文为河北省自然科学基金资助项目(No.H2015206376)。

通讯作者及指导教师：赵连梅(1981年-)，女，博士，助理研究员，主要从事基础免疫方面研究。

单保恩(1962年-)，男，医学博士，教授，博士生导师，主要从事基础免疫方面研究。