易　敏　王　嵘　沈婷婷

(青海省第五人民医院病理科，西宁810007)



microRNA-130b在结肠癌中的表达及生物学意义研究

易敏王嵘①沈婷婷

(青海省第五人民医院病理科，西宁810007)

[摘要]目的：研究微小RNA 130b(microRNA-130b，miR-130b)在结肠癌(Colonic carcinoma，CRC)中的表达情况及生物学意义。方法：收集2013年1月至2015年3月于我院普通外科行手术切除的CRC组织及对应癌旁组织共60例，运用qRT-PCR技术检测miR-130b在CRC组织及癌旁组织中的表达水平，统计分析miR-130b表达水平与患者临床病理资料间的相关性；采用人工合成的miR-130b模拟物转染人结肠癌SW480细胞，分别采用CCK-8分析、BrdU检测转染后细胞增殖变化，流式细胞仪及Caspase3/7活性分析检测转染后细胞凋亡变化。结果：miR-130b在CRC组织中表达水平显著高于对应癌旁组织(P<0.05)；miR-130b高表达与肿瘤体积增大(≥5 cm，P<0.05)及高TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期，P<0.05)显著相关；在人结肠癌SW480细胞中过表达miR-130b可显著抑制细胞增殖并促进细胞凋亡(P<0.05)。结论：miR-130b在结肠癌组织中表达下调并与肿瘤恶性临床病理特征有关，miR-130b可能通过抑制结肠癌细胞增殖、促进凋亡来抑制结肠癌的生长及发展。

[关键词]MicroRNA-130b；结肠癌；增殖；凋亡

结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤[1]，其生物学恶性程度高，疾病进展快，早期诊断困难，极大地危害广大人民群众的身体健康。近年来，针对EGFR分子的西妥昔单抗[2]及针对VEGF分子的贝伐单抗[3]等分子靶向药物在结肠癌的治疗中呈现出巨大优势。因而，寻找新的敏感而有效的肿瘤分子标志物成为提高我国结肠癌诊治水平的关键方法之一。

MicroRNAs(miRNA)是一类短链的非编码RNA，它能够与靶基因的mRNA特异性结合进而降解mRNA单链或抑制其翻译[4]。研究表明，结肠癌组织中存在多种miRNA的异常表达，如原癌性的miR-21在结肠癌组织中表达升高并与较晚的肿瘤临床分期相关，体外实验证实miR-21通过下调凋亡相关蛋白PDCD4(miR-21-ITGB4-PDCD4)来促进肿瘤抗凋亡作用[5]；而具有抑癌活性的miR-218可以通过降解BMI-1及CDK6等与肿瘤生长密切相关的分子来抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡[6]。miR-130b已经被证实是一种重要的肿瘤调节基因，在多种人类恶性肿瘤中存在表达异常升高[7]，并与肿瘤增殖、凋亡等多种生物学行为密切相关[8]。但是，miR-130b在人结肠癌中的临床病理意义及其具体分子机制尚不清楚。本研究通过检测miR-130b在结肠癌及对应癌旁组织中的表达情况及其对结肠癌细胞增殖、凋亡的调控作用，研究miR-130b在结肠癌发生、发展中的临床意义作用机制，为结肠癌的诊断与治疗提供新的分子靶点。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1临床标本本课题经我院医学伦理委员会批准审核后开展。收集2013年1月至2015年3月间于我院普通外科行手术切除的结肠癌及对应癌旁组织标本60例，其中男42例，女18例，年龄40～75岁，平均年龄(53.1±2.2)岁。所有入组患者术前均未接受放化疗。标本于离体30 min内取材，分别置于液氮或4%多聚甲醛溶液中保存。

1.1.2主要试剂Trizol试剂及脂质体2000(Lipofecta mineTM2000)购自美国Invitrogen公司；miRcute miRNA第一链cDNA合成试剂盒(KR201)和miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒(FP401)均购自北京天根生化科技有限公司；人结肠癌SW480细胞及正常人结肠FHC细胞购自中科院上海生物化学与细胞生物研究所；DMEM培养基及胎牛血清均购自美国Gibico公司；miR-130b特异性逆转录引物、RNU6B引物、人工合成的miR-130b抑制物(miR-130b inhibitor)及阴性对照microRNA inhibitor均购自上海吉凯基因化学技术有限公司；CCK-8试剂盒购自日本DOJINDO公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国Roche公司；BrdU细胞增殖检测试剂盒购自美国CST公司(#6813)；Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR按说明书提取结肠癌及对应癌旁组织中的RNA。先按说明书进行Poly A加尾及逆转录反应，合成cDNA。以2uL cDNA配制Real-time PCR体系，按如下条件进行PCR反应：预变性 94℃ 2 min,变性94℃ 20s,退火延伸 60℃ 34s,扩增40个循环。以RNU6B基因为内参，采用2-△△Ct法计算miR-130b相对表达量。每个样本独立重复实验3次。

1.2.2细胞培养SW480及FHC细胞株培养于含10%胎牛血清的1×DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2、饱和湿度下进行培养。每2～4日传代一次，稳定传代2～3代后，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.3细胞转染SW480细胞接种于6孔板中，用含10% FBS的1×DMEM培养基培养细胞至融合度达50%左右，实验分组及处理如下：实验组每孔加入100 pmol miR-130b inhibitor及5 μl转染试剂；对照组每孔加入100 pmol阴性对照(Negative Control,NC) inhibitor及5 μl转染试剂。每孔加入不含血清的1×DMEM培养基调整终体积至2 ml，置于37℃、5% CO2、饱和湿度下培养6 h后，更换完全培养基继续培养。独立重复实验3次。

1.2.4CCK-8细胞活性分析分别收集转染0、24、48、72 h后的SW480细胞，用无血清的DMEM培养基调整细胞密度为1×105ml-1，以200 μl/孔接种于96孔板，每组设6个复孔及1个空白对照孔，置于培养箱中过夜。每孔加入10 μl CCK-8溶液，继续孵育4 h，弃上清液，15 min内用酶标仪检测450 nm波长下的光密度(OD)值。每个样本独立重复实验3次。

1.2.5BrdU掺入试验按试剂说明书分别配制1×洗脱缓冲液、1×检测抗体溶液、1×HRP结合二抗溶液和10×BrdU溶液。将转染miR-130b inhibitor的SW480细胞以5 000/孔种植于96孔板，培养箱孵育24 h，加入1/10体积培养基的10×BrdU溶液，培养箱孵育24 h后，以300 g离心10 min，弃培养基，加入100 μl/孔的固定变形溶液，室温孵育30 min，移除固定液，加入100 μl/孔1×检测抗体溶液，室温孵育1 h，弃抗体检测溶液，1×洗脱缓冲液冲洗平板3次。加入100 μl/孔=1×HRP结合二抗溶液，室温孵育30 min，弃二抗工作液，1×洗脱缓冲液冲洗平板3次。加入100 μl TMB底物，室温孵育30 min后加入100终止溶液。30 min内450 nm吸光度进行检测。

1.2.6流式细胞仪检测取转染72 h后的SW480细胞，冷PBS溶液洗涤细胞2次，胰酶消化细胞，1 500 r/min离心5 min后弃去上清，1×Binding Buffer重悬细胞，调整细胞数为1×106ml后每管加入细胞悬液500 μl，再加入10 μl PI及5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI检测细胞凋亡。混匀后，室温下避光反应10 min，进行流式细胞仪检测。每组样本独立重复实验3次。

1.2.7Caspase3/7活性分析将转染72 h后的SW480细胞接种于96孔板，并设置3个空白孔。室温解冻100×Caspase底物和Apo-ONE® Caspase-3/7缓冲液，涡旋混匀。取100 μl底物加入9 900 μl缓冲液中配置Apo-ONE® Caspase-3/7试剂。每孔加入100 μl Apo-ONE® Caspase-3/7试剂，摇床轻微混匀30 s。室温孵育2 h，使用ELISA平板计数器测量490 nm细胞荧光强度。

2结果

2.1结肠癌组织及对应癌旁组织中miR-130b的相对表达量经qRT-PCR技术检测，60例结肠癌组织中miR-130b的平均相对表达量为(6.643±0.201)，而对应癌旁组织中miR-130b的平均相对表达量为(2.337±0.057)。统计学检验证明，miR-130b在结肠癌组织中的表达显著升高(P<0.05)。

图1　miR-130b在结肠癌及对应癌旁组织中的表达Fig.1　Relative expression of miR-130b in CRC and tumor adjacent tissuesNote: *.P<0.05.

表1miR-130b表达与结肠癌患者临床病理特征的关系(n=60)

Tab.1Clinical Correlation of miR-130b expression in CRC (n=60)

FeaturesClassificationmiR-130bexpressionlevelPAge<50year6.341±0.2110.337≥50year6.731±0.142GenderMale6.813±0.1210.408Female6.321±0.237Tumorvolume<5cm4.135±0.1070.0021)≥5cm8.137±0.132Numberofnodules16.641±0.2410.407≥26.801±0.172HistopathologicalG1～G26.217±0.1070.073GradeG36.791±0.129LymphaticNO5.398±0.0910.058MetastasisYES6.741±0.110Ⅰ～Ⅱ4.703±0.1020.0031)TNMstageⅢ～Ⅳ7.714±0.121

Note：1)P<0.05

2.2miR-130b表达与结肠癌临床病理特征间的相关性分析将结肠癌中miR-130b的平均相对表达量与患者年龄、性别、肿瘤体积、肿瘤数量、组织学分级、有无淋巴结转移及TNM分期等临床病理资料间的相关性进行统计学分析。统计学结果表明，结肠癌组织中miR-130b高表达与肿瘤体积增大(≥5 cm)及高TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期)呈正相关(P<0.05)，提示肿瘤组织中高表达的miR-130b可能影响肿瘤的生长及转移过程。

2.3下调结肠癌细胞中miR-130b的表达通过qRT-PCR分别检测结肠癌细胞SW480及正常结肠上皮细胞FHC中ZNF217的表达水平。结果发现，SW480中miR-130b的表达量均较FHC细胞显著升高(P<0.05，图2A)。我们在SW480细胞中转染入miR-130b抑制物(miR-130b inhibitor)，qRT-PCR检测证实miR-130b inhibitor可显著下调SW480细胞中miR-130b的表达水平(P<0.05，图2B)。

2.4下调miR-130b抑制SW480细胞增殖为研究抑制miR-130b表达对SW480增殖能力的影响，首先采用CCK-8法检测转染miR-130b inhibitor后24、48及72 h SW480细胞活力的变化，结果如图3A所示，与NC组相比，转染miR-130b inhibitor后可显著降低SW480细胞活力(P<0.05)。然后，我们将BrdU掺入转染细胞中，通过细胞免疫荧光染色，酶标仪分析发现miR-130b inhibitor转染后SW480细胞DNA合成能力显著降低[(117.290±7.541)vs(43.716±5.071)，P<0.05，图3B]，提示细胞增殖受到抑制。

2.5下调miR-130b促进SW480细胞凋亡肿瘤生长是细胞增殖和细胞凋亡共同作用的过程，因而，我们进一步通过流式细胞仪检测下调miR-130b表达对SW480细胞凋亡的作用。结果证实，在miR-130b inhibitor转染72 h后，miR-130b组细胞凋亡比例较NC组显著升高[(12.214±2.073)vs(28.974±2.805)，P<0.05,图4A、B]。Caspase3/7活性分析结果显示，下调miR-130b表达后SW480细胞内凋亡相关的酶活性显著增强[(115.718±11.314)vs(217.235±20.083)，P<0.05，图4C]。

图2　miR-130b inhibitor下调结肠癌细胞中miR-130b的表达水平Fig.2　miR-130b inhibitor down-regulated miR-130b expressionNote: A.Relative expression of miR-130b in FHC and SW480 cells；B.miR-130b inhibitor down-regulated miR-130b expression in SW480 cells.

图3　下调miR-130b抑制SW480细胞增殖能力Fig.3　Down-regulation of miR-130b inhibited SW480 cell proliferationNote: A.Down-regulation of miR-130b inhibited cell viability in SW480 cells (*.P<0.05)；B.Down-regulation of miR-130b inhibited DNA synthesis in SW480 cells (*.P<0.05).

图4　下调miR-130b对SW480细胞凋亡能力的影响Fig.4　Down-regulation of miR-130b enhanced SW480 cell apoptosisNote: A.Down-regulation of miR-130b increased cell apoptosis in SW480 cells (*.P<0.05)；B:Down-regulation of miR-130b enhanced Caspase 3/7 activity in SW480 cells (*.P<0.05).

3讨论

结肠癌是最常见的消化道肿瘤之一，国最新癌症5年生存率调查报告指出，结肠癌的5年生存率仅为47.2%[9]。目前，根治性手术及术后规范放、化疗是治疗结肠癌的主要方法[10]，但结肠癌早期诊断困难、易发生淋巴及远处转移，常使患者就诊时已失去根治性手术机会，对放化疗敏感性的个体差异也是导致部分患者术后早期复发、转移的主要原因。因而，寻找敏感而有效的结肠癌分子标志物及生物治疗靶点，成为提高结肠癌诊疗水平的重要方法之一。

结肠癌组织中存在大量microRNA异常表达，并在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[11]。例如，miR-218在结肠癌组织及细胞系中表达量均显著降低，体外过表达miR-218可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活而显著抑制结肠癌细胞的迁移及侵袭能力[12]；而结肠癌组织中处于高表达状态的miR-191能够通过抑制转录因子—正CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/Enhancer binding protein beta，C/EBP β) 的表达而促进细胞增殖和对5-Fu的化疗抵抗作用[13]。本课题通过研究证实，miR-130b在结肠癌组织中的表达水平显著高于对应癌旁组织，并且其高表达状态与肿瘤体积增大及高TNM分期等恶性临床病理特征密切相关。提示miR-130b在结肠癌生长中具有重要的调控作用。为了进一步证实miR-130b对结肠癌细胞的生长调控作用，应用人工合成的miR-130b抑制物在人结肠癌SW480细胞中下调miR-130b的表达水平，通过CCK-8分析及BrdU结合试验证实了下调miR-130b的表达能够有效抑制肿瘤细胞的增殖能力。流式细胞仪分析表明抑制miR-130b表达后，发生凋亡的肿瘤细胞比例显著提高；同时，细胞内凋亡相关酶caspase3/7的活性也显著增强。上述结果一致表明，miR-130b对结肠癌的生长具有一定的促进作用。

作为一种重要的原癌性microRNA，miR-130b可通过下调肿瘤中多个抑癌基因的表达水平来发挥促肿瘤作用，如在肝细胞癌中下调过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ)的表达来促进肝癌细胞侵袭[14]，在卵巢癌中下调多耐药基因1(Multidrug resistance 1，MDR1)的转录而诱导其对紫杉醇和顺铂耐药[15]等。值得注意的是，在前列腺癌中，miR-130b却呈现低表达状态，并且，在体外过表达miR-130b能够通过下调基质金属蛋白酶2(Matrix met allopeptidase 2，MMP2)来抑制肿瘤的转移。可见，miR-130b作为一种潜在的靶向治疗分子，其组织特异性和多靶点性对肿瘤个体化治疗提出了更高的要求。

总之，miR-130b在结肠癌组织中高表达，并且与肿瘤生长等恶性临床病理特征明显相关，下调

结肠癌细胞中miR-130b的表达能够显著抑制细胞增殖并促进其凋亡。因而，miR-130b作为一种潜在的靶向治疗分子在结肠癌的生物治疗中具有重要临床意义。

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[收稿2015-08-20修回2015-08-28]

(编辑许四平)

Expression and biological significance of microRNA-130b in human colonic carcinoma

YIMin,WANGRong,SHENTing-Ting.

TheFifthPeople′sHospitalofQinghaiProvince,Xining810007，China

[Abstract]Objective:To investigate the expression and biological significance of microRNA-130b in human colonic carcinoma(CRC).Methods: qRT-PCR was applied to detect the relative expression of miR-130b in 60 paired colonic carcinoma in comparison to the tumor adjacent tissues.Student-t test was used to analyze the relationship between the miR-130b expression and clinical features.We transfected the miR-130b inhibitor into SW480 cells,CCK-8 and BrdU incorporation assay were used to analyze cell proliferation,and flow cytometry and caspase3/7 activity assay were used to analyze cell apoptosis.Results: The relative expressions of miR-130b was significantly down-regulated in CRC tissues compared to those of the matched normal tumor-adjacent tissues(P<0.05).Low expression of miR-130b was significantly associated with large tumor size(≥5 cm,P<0.05) and advanced TNM stage(Ⅲ+Ⅳ,P<0.05).Overexpression of miR-130b in SW480 cells could significantly suppress cell proliferation and induce cell apoptosis(P<0.05).Conclusion: Low expression of miR-130b is related to the malignant clinicopathological features in CRC tissues,and miR-130b suppress colonic carcinoma growth and progression through inhibiting proliferation and enhancing apoptosis.

[Key words]MircoRNA-130b;Colonic carcinoma;Proliferation;Apoptosis

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.011

作者简介：易敏(1975年-)，女，病理科主任，主要从事消化道肿瘤、乳腺肿瘤及妇科肿瘤的研究，E-mail:yimin359@163.com。

中图分类号R735.3+5

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0652-05

①青海省第五人民医院肿瘤三科,西宁810007。