杜联峰　陈昆涛　丁立珉　唐艳丽　孙万邦

(遵义医学院珠海校区/贵州省免疫学研究生教育创新基地,珠海519041)



重组hIL-10联合MTX对AA大鼠IL-1β、TNF-α含量变化和影像学变化研究①

杜联峰陈昆涛丁立珉唐艳丽孙万邦②

(遵义医学院珠海校区/贵州省免疫学研究生教育创新基地,珠海519041)

[摘要]目的：以重组人白细胞介素-10(human interleukin-10，hIL-10)及其联合甲氨碟呤(MTX)作用佐剂性关节炎大鼠模型，检测血清IL-1β、TNF-α含量的变化情况，研究重组hIL-10联合MTX治疗佐剂性关节炎大鼠的效果。方法：AA大鼠造模后，用测量体重、足肿胀度、关节炎指数及组织病理学来评价造模是否成功， 各药物处理AA大鼠模型后，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清IL-1β、TNF-α的含量。用放射学检查来评估AA大鼠后足关节损伤的程度。 结果：各治疗组IL-1β、TNF-α含量比模型组水平明显下降，各治疗组与模型组比较有显著性差异(P<0.05)，联合用药组对AA大鼠血清IL-1β、TNF-α有明显的抑制作用，影像学检查提示IL-1β、TNF-α水平与大鼠足骨关节的损伤程度成正相关，联合用药组治疗后骨侵蚀评分最低。结论：各治疗组对佐剂性关节炎大鼠血清中细胞因子IL-1β、TNF-α有抑制作用，这种抑制作用与骨关节影像学改变显著相关。联合用药组能有效降低AA大鼠的IL-1β、TNF-α水平，改善AA大鼠足关节损伤的治疗作用。

[关键词]重组人白介素-10；佐剂性关节炎；IL-1β；TNF-α

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的以关节滑膜慢性炎症病变为主要表现的自身免疫性疾病，最终导致逐步和不可逆转的关节破坏，目前病因尚不清楚，发病率高[1]。近年研究证实RA发生与免疫调节功能紊乱有关，最新的研究表明在RA发生和发展中细胞因子IL-1β和TNF-α发挥了非常重要的作用[2,3]，IL-1β和TNF-α是重要的炎症介质，能促进骨髓释放中性粒细胞，诱导单核细胞和多核粒细胞趋化浸润到炎症局部，在局部释放溶酶体酶；能引起嗜碱粒细胞和肥大细胞脱颗粒，释放炎症介质，IL-1β和TNF-α是促使RA病理发展的重要细胞因子，在类风湿性关节炎的关节腔中可检出IL-1β和TNF-α含量的增加[4]。甲氨蝶呤(MTX)是治疗类风湿性关节炎的一种重要的改善病情的抗风湿药，临床上已普遍引用，既往研究发现MTX主要是通过其细胞内代谢产生多聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTXPG)发挥治疗作用及导致不良反应的发生[5]。最新研究发现甲氨蝶呤可以通过阻止激活腺苷A2A受体，增加细胞内腺苷(Adenosine)浓度，增加cAMP水平来抑制TNF、IL-1、IL-6等炎性细胞因子的分泌和细胞吞噬来减轻骨关节炎症[6]。但是，MTX治疗类风湿性关节炎存在很大的副作用，主要是消化道症状以及减少血液的白细胞、血小板的数量以及影响肝功能等。最新的研究表明白细胞介素10是一种体内重要免疫负向调控的细胞因子，IL-10能够抑制活化及效应性T细胞、巨噬细胞功能，介导免疫抑制作用[4,5]。研究发现在类风湿性关节炎患者中IL-10水平降低。IL-10在RA中主要由关节部位巨噬细胞和T细胞产生，其可通过抑制炎性细胞因子的分泌，减轻关节的肿胀和炎性细胞浸润及炎性渗出物的产生，具有明显的免疫抑制功能，目前发现IL-10可以作为一种辅助治疗类风湿性关节炎的新型细胞因子，来减轻MTX在治疗RA患者时的副作用。本研究拟应用重组hIL-10及其联合甲氨碟呤作用于佐剂性关节炎大鼠模型，检测大鼠血清中IL-1β和TNF-α水平的变化情况，同时通过后足的影像学检查来评估AA大鼠关节损伤的程度，为重组IL-10在治疗类风湿关节炎的应用提供实验数据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物健康SPF级SD大鼠40只，雌性，由广东省实验大鼠中心提供[许可证号SCXK(粤)2008-0002]。在遵义医学院珠海校区动物实验中心饲养。

1.1.2主要试剂与实验仪器弗氏完全佐剂，Rat IL-1β ELISA Kit和Rat TNF-α ELISA Kit购自欣博盛生物科技有限公司，MTX 购自广东岭南制药有限公司，重组人IL-10购自PeproTech生物公司， ELx-800型酶标仪等。

1.2实验方法

1.2.1动物分组及动物模型的建立40只SD大鼠编号以后按随机数字表法分为两组，空白对照组8只SD大鼠，AA大鼠模型组32只SD大鼠，AA大鼠模型组造模：将卡介苗于80℃灭活后加入弗氏不完全佐剂中充分乳化混匀配成(10 mg/ml)的弗氏完全佐剂，于左侧足底皮下注射0.1 ml建立AA模型。20 d后同法加强免疫1次，加强免疫后15 d后造模成功，随机分为四组，既模型对照组、IL-10治疗组、MTX治疗组、IL-10与MTX联合治疗组，每组8只。三个治疗组自造模成功日起再给药15 d。给药剂量及具体方法见表1。

1.2.2实验大鼠体重变化观测AA大鼠模型分别在造模前与治疗终止时，称量并记录大鼠造模前及治疗后的体重变化，作为慢性炎症的度量指标。

1.2.3AA大鼠模型排水法检测足肿胀度在造模后7、14、21、28、35 d，对每组大鼠足跖部用排水法进行测量，将大鼠后肢放入装满水的刻度玻璃容器中，刚好没过大鼠踝关节，重复测量3次，记录每次排水量，取平均值。

1.2.4AA大鼠模型关节炎指数评定 在造模后7、14、21、28、35 d，根据关节红肿程度进行关节炎指数(AI)的评定，关节炎指数评定标准如下：0分：正常无红肿；1分：单个足趾发红、肿胀； 2分：多个足趾和足底出现肿胀；3分：踝关节以下全部肿胀；4分：踝关节以上受累且不能负重。AI=四肢关节评分之和。大鼠关节评分AI≥6分被认定造模成功。

1.2.5AA大鼠模型关节滑膜病理学改变取正常大鼠与AA模型大鼠处死，打开关节腔，完整剥离滑膜组织，置新鲜配制的4%多聚甲醛固定，滑膜组织石蜡包埋后切片作HE染色。

1.2.6血清IL-1β和TNF-α检测各组末次给药后通过内眦采血2 ml，分离血清，ELISA法检测血清中细胞因子IL-1β和TNF-α含量。

1.2.7病理学及影像学检测骨关节损伤程度AA大鼠治疗组分别在治疗前与治疗终止时，通过DR X射线对原发侧左后足进行摄片(摄片条件为25 KV，1.0 S，电流4 mA)，对关节破坏和关节周围侵蚀性变化的程度进行测量[7]，X光片的得分从0～4表示不同的骨侵蚀度：0分=正常无骨质破坏；1分=疑似或者1个微小局部病灶；2分=2个局部病灶或者病灶总面积≤50%，轻度至中度关节破坏；3分=3个以上病灶或者病灶总面积≥50，中度关节破坏；4分=关节面完全被破坏或者可见骨缩小，具有明显的关节周围糜烂性改变的严重关节破坏。所有的分数计算以影像学人员判定为准。同时，AA大鼠治疗组分别在治疗前与治疗终止后，取滑膜组织，用4%多聚甲醛固定，滑膜组织石蜡包埋后切片作HE染色。

表1AA大鼠造模成功后实验分组及给药方案(n=8)

Tab.1Grouping and dosing regimen after AA rats model succeed(n=8)

GroupsDoseAdministereddays(d)RouteofadministrationFrequencyofadministrationNormalNS1ml/kg15EnterocoeliaEveryotherdayModelNS1ml/kg15EnterocoeliaEveryotherdayIL-105μg/kg15EnterocoeliaEveryotherdayMTX1mg/kg15EnterocoeliaEveryotherdayJoint3μg/kgIL-10+1mg/kgMTX15EnterocoeliaEveryotherday

2结果

2.1大鼠佐剂性关节炎模型结果

2.1.1实验大鼠体重变化如表2所示，AA大鼠模型组发生了体重减轻，而正常对照组大鼠体重随饲养时间的增加逐渐在增加，各治疗组小鼠的体重和模型对照组相比较明显的增加，说明治疗组能够减轻佐剂性关节炎所引起的体重减轻。

2.1.2AA大鼠足肿胀度结果模型组大鼠于注射弗氏完全佐剂24 h后注射侧开始出现轻、中度红肿，第14天注射侧足肿胀度达到高峰，在第21天检测注射侧足肿胀度与第14天相比出现了下降，但是在第20天加强免疫后，第28天检测时足肿胀度又达到高峰。对照组未出现上述表现。在造模35 d过程中，模型组大鼠足肿胀度与正常对照组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，结果见图1。

2.1.3实验大鼠关节炎指数在造模35 d观察过程中，模型组大鼠与正常对照组比较，造模14 d后，大鼠主要表现为原发侧关节炎指数变化明显增加，出现关节红肿变化。造模14 d后关节炎指数均大于6，结果见图2，说明造模成功。

2.1.4AA大鼠模型关节滑膜病理学变化滑膜组织切片，经HE染色，显微镜下观察组织病理改变。结果显示：正常组大鼠滑膜组织主要由疏松结缔组织组成，表面可见滑膜绒毛，结构正常，无炎性细胞浸润。AA大鼠模型组滑膜组织血管增生充血，可见大量淋巴细胞、巨噬细胞及嗜酸性细胞等慢性炎细胞浸润，但关节软骨未见明显破坏，结果见图3。

GroupsBodyweight(g)Modelingago(0d)Aftertreatment(45d)Numberofweightchange(g)Normalgroup189.12±2.64250.15±6.7361.24±6.73Modelgroup186.16±3.18189.12±2.361)3.10±3.361)IL-10group190.50±2.89245.60±5.002)55.08±5.042)MTXgroup187.14±2.48239.26±4.322)42.60±3.322)Jointgroup186.51±3.47245.23±2.412)58.50±3.412)

Note：Compared with normal group,1)P<0.05；compared with model group ，2)P<0.05.

2.2各治疗组对AA大鼠血清中IL-1β、TNF-α的影响模型组的大鼠血清中IL-1β、TNF-α含量明显升高，与正常对照组相比差异显著(P<0.05)，说明这两种细胞因子对佐剂关节炎大鼠发挥重要的致炎作用，各治疗组与模型组相比血清中IL-1β、TNF-α含量明显下降，说明各治疗组对佐剂性关节炎大鼠血清中IL-1β、TNF-α有一定的抑制作用。经组间比较发现联合用药组IL-1β、TNF-α水平下降最多，与IL-10组和MTX组比较差异有统计学意义(P<0.05)，MTX组的治疗效果优于IL-10组(P<0.05)，联合用药组的治疗效果最好。见表3。

图1　AA大鼠造模后足肿胀度的变化Fig.1　Changes swelling of paw on AA rats modelNote: Compared with model group,*.P<0.05.

图2　AA大鼠关节炎指数的变化Fig.2　Result of arthritis index on AA rats model

图3　正常组和模型组大鼠关节滑膜组织病理结果(HE ×400)Fig.3　Synovial tissue of histopathological change in control group and model group(HE ×400)Note: A.The synovial tissue of the normal group;B.Obvious inflammatory cell infiltrate in the synovial tissue of the model group.

GroupsIL-1β(ng/L)TNF-α(ng/L)Normalgroup48.01±9.541)62.56±8.451)Modelgroup272.77±8.26407.16±8.67IL-10group133.02±9.951)258.10±9.681)MTXgroup118.87±7.081)2)127.16±7.671)2)Jointgroup64.95±6.571)2)3)101.21±6.521)2)3)

Note：Compared with model group,1)P<0.05，Compared with IL-10 group,2)P<0.05， Compard with MTX group,3)P<0.05.

图4　AA大鼠足关节X线影像学评分结果Fig.4　Score of X-ray imaging observation on paws of AA ratsNote: Compared with model group,*.P<0.05.

2.3AA大鼠X线影像学结果根据X线影像结果，按照骨侵蚀评分指标相对进行量化比较，骨侵蚀评分MTX、联合组分别与模型组比较，P<0.05有统计学差异，结果见图4。

3讨论

随着对RA发病机制的不断深入研究，由免疫系统过量产生多种细胞因子在RA的发病机理中起重要作用。其中由单核-巨噬细胞分泌的细胞因子IL-1β、TNF-α在RA发病过程中起到了非常重要的作用。IL-1β是RA发病过程中的主要促炎细胞因子，在类风湿性关节炎损伤关节的过程中，它改变软骨细胞合成代谢，通过刺激软骨细胞来增强诱导MAPKs的信号传导途径，最终导致了许多炎性介质包括基质金属蛋白酶(MMP)的表达，如MMP-1、 MMP-3、MMP-13和蛋白聚糖酶表达上调，NO、PGE2和环氧合酶-2(COX-2)等合成增加[8]。大量的研究也证实， IL-1β在人的类风湿性关节炎中的关节软骨、滑膜细胞、软骨细胞中被发现。因此，IL-1β与类风湿性关节炎有密切的关系，被认为是导致关节软骨变性的关键细胞因子。研究发现在佐剂性关节炎模型中早期阶段的特征是一种全身性TNF-α水平含量的增加，TNF-α被认为是在炎性疾病中发挥主导作用的细胞因子，它能通过激活血管内皮细胞，使其黏附分子的表达增加，在关节发生炎症时，血液中的白细胞正是通过与黏附分子相互作用被汇集到关节腔；刺激产生多种小分子炎性递质，如前列腺素等；同时通过直接刺激滑膜细胞和软骨细胞产生基质金属蛋白酶，导致骨和软骨的破坏。我们的研究结果显示：各治疗组与模型组相比血清中TNF-α含量明显下降，其中重组hIL-10组的抗炎作用较MTX组和联合用药组弱，联合用药组和MTX组具有较好的抗炎作用，能有效降低血清中TNF-α含量，其中联合用药组的效果最好。结果表明重组hIL-10在AA大鼠模型中有一定的抗炎作用，目前大量研究也证实IL-10是在RA发病过程中起保护作用的重要细胞因子。其治疗类风湿性关节炎的机制可能是IL-10可抑制MMPs产生及IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α的释放，并促进IL-1RA和可溶性TNF受体的产生，抑制T细胞的增殖。通过对血清中细胞因子IL-1β、TNF-α分泌水平产生明显的抑制作用，从而阻止滑膜成纤维细胞的过度增殖，在细胞因子网络水平上发挥免疫调控作用达到抗类风湿关节炎的目的。本文实验结果表明，本研究在AA大鼠药物治疗15 d后，AA大鼠血清中IL-1β、TNF-α分泌水平发生不同程度的降低。各治疗组组间比较，联合组能明显抑制IL-1β、TNF-α在血清中的含量水平，和MTX组和IL-10组对比有显著性差异，对调节IL-1β、TNF-α分泌水平的效果最好。说明联合用药组能有效减少AA大鼠血清中IL-1β、TNF-α的含量水平，从而起到减轻关节炎的作用。

在骨关节炎疾病中，X射线对骨关节的照片分析，仍然是临床和实验中常用于评估疾病进展的重要指标方法[10，11]，本研究在AA大鼠药物治疗15 d后，MTX组、IL-10组及两者联合组的关节病变与模型组比较，病变程度有所减轻，X线影像显示治疗后骨侵蚀评分降低，关节面损伤有一定程度改善，药物治疗前后在软组织肿胀、骨侵蚀的评分方面看到相同的规律，以联合用药组的治疗效果最明显。

甲氨蝶呤是目前治疗RA首选的缓解病情药物，也是联合治疗方案中最基础的药物。根据类风湿关节炎RA新的分类标准及其方法学的推荐意见[12，13]，一旦诊断明确，主张早期应用MTX，或以此为基础进行联合治疗。本研究中使用甲氨蝶呤做对照组，结果具有可比性。本实验结果显示重组hIL-10联合MTX治疗AA大鼠后的各项指标都优于单用MTX组，说明生物制剂hIL-10与化疗药MTX联合有一定的优势，为进一步探讨生物制剂重组hIL-10联合化学药物MTX治疗RA提供实验基础数据。

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[收稿2015-08-25修回2015-10-15]

(编辑倪鹏)

Effect of recombinant hIL-10 plus MTX on change of IL-1β，TNF-α level and medical imaging of an AA rat model

DULian-Feng，CHENKun-Tao，DINGLi-Min，TANGYan-Li，SUNWan-Bang.

ZunyiMedicalCollegeCampusinZhuhai/GraduateEducationandInnovationBaseofImmunologyinGuizhouProvince，Zhuhai519041，China

[Abstract]Objective:Adjuvant arthritis(AA)rats interfered with recombinant hIL-10,methotrexate(MTX)and IL-10 plus MTX separately,we detected the changes of IL-1β and TNF-α in rat′s serum.Methods: AA rats after interfered with recombinant hIL-10,MTX and IL-10 plus MTX.The levels of IL-1β，TNF-α in serum of rats were measured by ELISA method.with radiological examination to evaluate the degree of AA paw joint damage.Results: Compared to normal control group,the IL-1β，TNF-α of treatment group was significantly decreased,there was a significant differences compared with control group(P<0.05),The Combination group had significant difference compared with MTX group and IL-10 group，radiological examinations showed IL-1β,TNF-α levels and degree of AA paw joint damage were positive correlation,the combination group therapy bone erosion score lowest.Conclusion: Marked alteration in the serum level of IL-1β,TNF-α on Each treatment group of adjuvant arthritis in rats,these alterations of cytokine levels were associated with significant radiological changes of the joints.The combined group can effectively reduce levels of IL-1β,TNF-α and improve therapeutic effect of paw joint injury in AA rats.

[Key words]Recombinant hIL-10；Adjuvant arthritis；IL-1β；TNF-α

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.004

作者简介：杜联峰(1976年-)，男，硕士，副教授，主要从事分子免疫学研究，E-mail：8wy149842@163.com。

中图分类号R392.31

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0624-05

①本文受贵州省教育厅自然科学项目(2008032)资助。

②通讯作者，E-mail:sunwb7224@sina.com。