缪 东，舒 燕，邬里洋，周映华，王升平，高书锋，周小玲，曾发娇

（湖南省微生物研究院，湖南　长沙 410009）



白僵菌生产中防霉剂的应用研究

缪 东，舒 燕，邬里洋，周映华，王升平，高书锋，周小玲，曾发娇

（湖南省微生物研究院，湖南长沙 410009）

摘 要：为了解决白僵菌固体培养时易遭受霉菌污染问题，以玉米螟白僵菌ABUV-3和松毛虫白僵菌DBUV-7为供试菌株，对40%克菌灵等5种防霉剂进行了系列研究。结果表明：5种防霉剂对毛霉菌、木霉菌、根霉菌、绿霉菌和黄曲霉菌的孢子和菌体均有抑制作用，其中以70%菌绝杀可溶性和绿霉霸粉剂的抑制效果最好；虽然5种防霉剂直接作用时会对白僵菌的孢子萌发产生抑制作用，但在固体培养生产孢子时添加一定量的防霉剂，对孢子产量及其萌发并没有抑制作用。因此，建议在白僵菌生产过程中，在固体培养基中添加70%菌决杀和绿霉霸粉剂500倍液（折合剂量为2 mg/mL），用以抑制霉菌的污染。

关键词：白僵菌；防霉剂；孢子萌发；霉菌污染

白僵菌是一种半知菌类广谱性寄生虫真菌，自1890年美国堪萨斯州首次利用白僵菌成功地防治麦长蝽以来，该真菌在农林牧草害虫防治领域的应用已超过100 a的历史，取得了较好的经济和社会效益，其防治对象涉及9个目34科的200种害虫［1-2］。白僵菌防治害虫的原理是以分生孢子寄生虫体而致使其死亡。目前，白僵菌分生孢子主要通过固体培养获得，而固体培养一般采取开放式培养方式，培养基裸露于空气中，易受各种霉菌的污染，造成损失［3-7］。因此，为了解决白僵菌生产中的霉菌污染问题，实现白僵菌孢子稳产高产，以玉米螟白僵菌ABUV-3和松毛虫白僵菌 DBUV-7为供试菌株，对40%克菌灵等5种防霉剂进行了系列研究，以期为白僵菌在作物病虫害防治领域的应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌种 玉米螟白僵菌 ABUV-3来自湖南省微生物研究所，松毛虫白僵菌 DBUV-7从溆浦县微生物所引进，毛霉菌，根霉菌、木霉菌、绿霉菌和黄曲霉菌从食用菌污染中分离纯化获得。

1.1.2 供试防霉剂 40%克霉灵可湿性粉剂和40%克霉净粉剂（山西省运城市玉化工实验厂），70%菌绝杀可溶性粉剂（山西省运城市丰玉化工实验厂），绿霉霸（山西省永济市君宏应用化工厂），草酸（广州化学试剂厂）。

1.1.3 培养基 （1）白僵菌液体培养基：土豆20%，葡萄糖20%，蛋白胨0.5%。（2）白僵菌固体培养基：麦麸70%，米粉10%，糠壳20%。（3）霉菌液体培养基：土豆20%，葡萄糖2%。（4） 霉菌固体平板培养基：土豆20%，葡萄糖2%， 琼脂2%。

1.2 试验方法

1.2.1 不同种类防霉剂对白僵菌分生孢子萌发的影响以白僵菌液体培养基为溶剂，将防霉剂稀释成100、200、300、400、500倍的霉菌稀释液，每个浓度设3次重复，高压消毒20 min，冷却备用。每个三角摇瓶（容量300 mL，装液量1/3）接白僵菌孢子粉一环，置25℃恒温摇床（200 r/min）培养，从培养16 h开始每隔4 h取样一次，在显微镜下检查孢子的萌发情况，以不加防霉剂的白僵菌培养液作空白对照。

1.2.2 不同种类防霉剂对霉菌孢子萌发的影响 以霉菌液体培养基为溶剂，将防霉剂配制成10 mg/mL的母液，在此基础上将各防霉剂母液稀释成100、200、300、400、500倍的霉菌稀释液，每个浓度设3次重复，高压消毒20 min，冷却备用。接种不同霉菌孢子粉一环，置25℃恒温箱中培养，每4 h取样1次，在显微镜下观察孢子萌发和菌丝体生长情况。

1.2.3 不同浓度防霉剂涂布对霉菌菌丝生长的影响用无菌水作溶剂，将防霉剂配制成10 mg/mL的母液，在此基础上将各防霉剂母液稀释成100、200、300、400、500倍的霉菌稀释液，每种防霉剂每个浓度吸0.2 mL涂布到霉菌培养平板上，以无菌水作空白对照，置25℃恒温箱中培养，每隔4 h观察平板上霉菌菌丝体生长变化的情况。

1.2.4 不同种类防霉剂对白僵菌产孢量的影响 用自来水配制不同浓度的防霉剂稀释夜，在白僵菌固体培养基中加入75%的防霉剂，搅拌均匀，堆制后用塑料布盖上闷1 h左右；每个处理接种25%的白僵菌种子发酵液，搅拌均匀用塑料框盛装，厚度约16 cm，25℃恒温保湿培养，待形成分生孢子后停止培养，40℃下干燥，均匀取样；称取1 g样品，捣碎，用0.1%吐温作稀释剂，根据产孢量的多少进行适当稀释，在显微镜下用血球板计算白僵菌产孢量。

1.2.5 添加防霉剂生产的白僵菌分生孢子萌发率的检测 将不同种类防霉剂生产的白僵菌孢子粉接种至白僵菌孢子萌发培养液中，放置在25℃恒温摇床上（200 r/min）培养；从培养16 h开始，每2 h取样1次，在显微镜下观察孢子萌发情况，每种每次观察100个孢子，以不加防霉剂培养的白僵菌孢子粉作空白对照，比较其萌发率。

2 结果与分析

2.1 不同种类防霉剂对白僵菌分生孢子萌发的影响

从表1中可以看出，各防霉剂对白僵菌孢子萌发均有不同程度的抑制作用；其中，以70%菌绝杀和绿霉霸粉剂的抑制作用最明显，100～400倍稀释液条件下白僵菌孢子均不能萌发；40%克霉灵可湿性粉剂、40%克霉净粉剂、草酸对白僵菌孢子萌发的抑制浓度分别为100倍、100倍、200倍。这表明，各防霉剂对白僵菌分生孢子的抑制作用由高到低依次为70%菌绝杀＞绿霉霸粉剂＞40%克霉灵可湿性粉剂＞40%克霉净粉剂＞草酸，其对白僵菌分生孢子的抑制剂量分别为1.75、2.5、4.0、4.0和5.0 mg/mL。

表1 不同种类防霉剂处理对白僵菌分生孢子萌发抑制作用的比较

2.2 不同种类防霉剂对霉菌孢子萌发的影响

从表2中可以看出，不同种类防霉剂对同一霉菌的抑制作用有差异，同一种防霉剂对不同霉菌的抑制作用也有区别。其中，70%菌绝杀和绿霉霸粉剂的抑霉效果最显著，稀释500倍时，绿霉菌和黄霉菌孢子均未萌芽，而毛霉菌、木霉菌和根霉菌孢子在稀释400倍时也不能萌芽；其他3种防霉剂对霉菌的抑制浓度为100～200倍液。

2.3 不同浓度防霉剂涂布对霉菌菌丝生长的影响

表2 不同种类防霉剂处理对霉菌孢子萌发抑制作用的比较

由表3可知，70%菌绝杀和绿霉霸的抑霉效果最好，不同稀释倍数涂布，5种霉菌的菌丝生长均受抑制；其中，70%菌绝杀粉剂，稀释200倍涂布时根霉菌和绿霉菌的菌丝溶解变色，稀释100倍涂布时，木霉菌和黄霉菌的菌丝溶解变色；绿霉霸粉剂稀释300涂布时，绿霉菌的菌丝溶解变色。40%克霉灵可湿性粉稀释300倍涂布时，5种霉菌的菌丝生长均受抑制。40%克霉净粉稀释300倍涂布时，毛霉菌和木霉菌的菌丝生长均受抑制；稀释200倍涂布时，根霉菌、绿霉菌和黄霉菌的菌丝生长均受抑制。草酸稀释200倍涂布时，毛霉菌、木霉菌、根霉菌和绿霉菌的菌丝生长均受抑制；稀释100倍时，黄霉菌的菌丝生长均受抑制。

表3 不同浓度防霉剂涂布对霉菌菌丝生长的影响

2.4 不同种类防霉剂对白僵菌产孢量的影响

从表4中可以看出，在固体培养基中添加稀释300倍的防霉剂，各处理的孢子产量与对照处理差异不显著，且能有效抑制霉菌的生长。这说明通过防霉剂抑制白僵菌分生孢子生产中霉菌的发生切实可行。

2.5 添加防霉剂生产的白僵菌分生孢子萌发率的检测

表4 不同种类防霉剂处理对白僵菌产孢量的影响

由表5可知，与对照相比，添加了防霉剂生产的白僵菌分生孢子萌发时并未见异常，培养28 h后孢子萌发率均达100%。这进一步证明，防霉剂对白僵菌没有产生不良影响，不会妨碍其病虫害防治效果。

表5 培养基中加入防霉剂生产的白僵菌孢子萌发率的比较

3 小结与讨论

通过对防霉剂一系列的试验研究，结果表明，40%克菌灵等5种防霉剂直接作用时，对白僵菌ABUV-3和DBUV-7的孢子萌发都将产生不同程度的抑制作用，但种类及作用浓度不同时抑制作用表现出一定差异，由高到低依次为70%菌绝杀＞绿霉霸粉剂＞40%克霉灵可湿性粉剂＞40%克霉净粉剂＞草酸，其对白僵菌分生孢子的抑制剂量分别为1.75、2.5、4.0、4.0和5.0 mg/mL。

5种防霉剂对毛霉菌、木霉菌、根霉菌、绿霉菌和黄曲霉菌的孢子和菌体均有抑制作用。其中，以70%菌绝杀可溶性和绿霉霸粉剂的抑制效果最好，不仅可抑制霉菌孢子萌发，而且可使菌丝体自溶变色。这可能是因为霉菌吸收防霉剂药物后，细胞质发生了变化，破坏了酶活性，导致蛋白变性所引起的，其详细作用机理有待进一步研究。

将防霉剂添加到白僵菌固体培养基中进行白僵菌孢子生产，在稀释浓度为300倍时，其孢子产量与空白对照没有明显差异，且孢子萌发率不受影响。

综上所述，建议在白僵菌生产过程中，可在固体培养基中添加70%菌决杀和绿霉霸粉剂500倍液（折合剂量为2 mg/mL），用以抑制霉菌的污染。

参考文献：

［1］ 查玉平，陈京元，夏剑萍. 白僵菌防治森林害虫的研究与应用［J］.湖北林业科技，2010，（3）：40-42.

［2］ 赫英伟. 白僵菌的研究概况［J］. 黑龙江农业科学，2010，（4）：145-147.

［3］ 李述逑. 白僵菌生产中抑菌剂的筛选及应用［J］. 吉林农业大学学报，1989，11（1）：52-55.

［4］ 崔永兰，李兰珍，宋友发，等. 化学农药对白僵菌的影响及菌药合用初步研究［J］. 森林病虫通讯，1997，（1）：6-9.

［5］ 李增智，汤 坚. 12种化学杀虫剂对3种虫生真菌孢子萌发影响的研究［J］. 安徽农业大学学报，1996，23（3）：360-365.

［6］ 余婉清. 白僵菌生物学特性及防治研究［J］. 绿色大世界-绿色科技，2010，（5）：122-123.

［7］ 张晓敏，杨 帆，郭秀玉，等. 不同条件对球孢白僵菌分生孢子萌发的影响［J］. 内蒙古农业大学学报（自然科学版），2010，31（4）：43-46.

（责任编辑：成 平）

Application Research on Mould Inhibitors Production of Beauveria bassiana

MIAO Dong，SHU Yan，WU Li-yang，ZHOU Ying-hua，WANG Sheng-ping，GAO Shu-fen，ZHOU Xiao-ling，ZENG Fa-jiao
（Hunan Institute of Microbiolgy， Changsha 410009， PRC）

Abstract：In order to solve the problem of Beauveria bassiana vulnerable to mould contamination in solid culture， the corn borer Beauveria bassiana ABUV-3 and the pine caterpillars Beauveria bassiana DBUV-7 as for the tested strains， a series of studies of 40% Kejunling and other five kinds of mould inhibitors were conducted. The results showed that the five kinds of mould inhibitors on spores and bacteria of Mucor， Trichoderma， Rhizopus， green mould and Aspergillus flavus all have inhibitory effect， in which the inhibitory effects， the 70% of soluble Junjuesha and Lvmeiba powder was the best； although the direct action of the 5 mould inhibitors will bring inhibited effect on the spore germination of Beauveria bassiana， there was no inhibitory effect on spore production and germination by adding a certain amount of mould inhibitor when producing spore in solid culture. Therefore， it is suggested that in the process of production of Beauveria bassiana， in solid culture medium added with 500 times liquid of 70% Junjuesha and Lvmeiba powder （equivalent dose for 2 mg / mL） to inhibit mould contamination.

Key words：Beauveria bassiana； mould inhibitors； spore germination； mould contamination

中图分类号：S476.15

文献标识码：A

文章编号：1006-060X（2016）05-0008-04

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.05.003

收稿日期：2016-02-29

基金项目：湖南省科技厅重点项目（2011NK2013）；湖南省科技成果重点推广项目（2011CK2006）

作者简介：缪 东（1974-），男，湖南长沙市人，助理研究员，主要从事动物营养及饲料研究。