姜上川+梅超+王小芳+张大鹏

摘要：植物激素脱落酸（ABA）参与调控植物生长发育各个阶段，并在植物对多种胁迫的抗逆反应中起着重要作用。PPR基因家族是拟南芥最大的基因家族之一，PPR蛋白在调控植物生长发育与响应逆境胁迫过程中发挥重要作用，然而参与ABA信号转导的线粒体PPR蛋白仍有待进一步研究。本研究发现拟南芥线粒体PPR蛋白APPR6的2个T-DNA插入突变体在萌发与萌发后幼苗早期生长过程中对外源ABA超敏，报道APPR6参与ABA信号转导为进一步阐明线粒体PPR蛋白的作用机制以及复杂的ABA信号网络提供了新的信息。

关键词：脱落酸（ABA）；APPR6；PPR蛋白；种子萌发；幼苗生长；拟南芥

中图分类号： Q945.3

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0053-05

PPR（pentatricopeptide repeats）蛋白是拟南芥中最大的细胞核编码的蛋白家族之一，最早在拟南芥基因组序列中发现[1]。在拟南芥中约有450个PPR蛋白，其他陆生植物基因组序列中可编码更多[2-3]，并且来自不同种属的PPR蛋白具有高度同源性。PPR蛋白的主要结构特征是以35个氨基酸为重复单位连续排列，串联重复可达到30次[2]。PPR蛋白在细胞内主要分布在线粒体与叶绿体中，在线粒体和叶绿体等细胞器RNA代谢过程中起着重要作用[3]，包括RNA剪接[4-6]、稳定[7]、编辑[8-11]、加工[12]以及蛋白质翻译起始和核糖体组装等[13]。大量研究表明，PPR具有直接结合RNA功能，通过PPR基序形成的螺旋结构直接结合RNA，或与其辅助因子共同结合RNA[2-3]。近年来结构生物学研究为进一步阐明PPR蛋白的识别机理与识别密码奠定基础[14]。

脱落酸（ABA）是植物体内最重要的激素之一，参与调控植物生长发育各个阶段，并在植物应对干旱、渗透、盐、低温等非生物胁迫以及病虫害等生物胁迫的响应中起着重要作用[15-16]。定位在线粒体或叶绿体的PPR蛋白在调控植物生长发育与逆境胁迫响应的过程中发挥重要作用[2-3]。有的PPR蛋白还与雄性胞质不育有密切联系[17-18]。目前人们在拟南芥中已经发现几个线粒体定位的PPR蛋白参与了ABA信号转导过程，包括ABO5[4]、SLO2[9]、SLG1[10]、AHG11[11]、PPR40[19]与PGN[20]等，这几种PPR蛋白通过调控线粒体中活性氧（ROS）的变化参与ABA信号转导过程。然而在拟南芥庞大的PPR蛋白家族中，仍有更多可能参与ABA信号转导的线粒体PPR蛋白有待鉴定。

最近研究发现拟南芥线粒体PPR蛋白APPR6参与调控胚胎发育过程[21]。APPR6（At1g77360）的3个T-DNA插入突变体SALK_045714（appr6-1）、SALK_091917（appr6-2）和SALK_061950（appr6-3）的杂合体中，仅3/4的种子能够萌发并且没有纯合体植株；另外1/4纯合体种子在发育的角果中颜色透明、胚胎发育迟缓，成熟后干种子体积小、皱缩，在土中不能直接萌发，而在含有蔗糖的MS培养基上表现为生长发育严重滞后、植株矮小等[21]。然而对于APPR6在拟南芥中的其他功能仍有待研究。

本研究通过鉴定APPR6另外2个T-DNA插入突变体SALK_078430（appr6-4）与SALK_005601（appr6-5）在种子萌发与萌发后幼苗早期生长过程中对ABA的响应，发现 APPR6 参与ABA信号转导，为进一步阐明线粒体PPR蛋白的作用机制以及ABA信号网络奠定基础。1 材料与方法

1.1 植物材料

拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型（Col）种子购自美国俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心（Arabidopsis Biological Resource Center，Ohio State University，USA，简称ABRC）。

APPR6（At1g77360）基因T-DNA插入突变体SALK_078430（appr6-4）以及SALK_005601（appr6-5）种子购自ABRC，其遗传背景为Col生态型。

ABI1（AT4G26080）基因T-DNA插入突变体abi1-3（SALK_076309）、ABI2（AT5G57050）基因T-DNA插入突变体abi2-2（SALK_015166）购自ABRC，其遗传背景为Col生态型。abi1-3 abi2-2双突变体纯合体由中国农业大学生命科学学院郭岩教授馈赠。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥种植 将适量拟南芥种子用0.5%次氯酸钠（NaClO）表面消毒，振荡20 min后用无菌水漂洗5次，播种于固体MS[22]培养基（MS干粉 4.43 g/L，蔗糖30 g/L，琼脂 7～8 g/L，pH值5.8～6.0）上，将培养皿置于4 ℃环境中低温处理3 d后取出，置于光照培养箱中培养10～14 d，光周期为光照16 h—黑暗8 h，温度20 ℃，光照度约80 μmol/（m2·s）。将适龄幼苗移栽入小盆中，种植用土的成分体积配比为营养土 ∶草炭土 ∶蛭石=2 ∶1 ∶1。幼苗覆膜培养5 d后揭膜，光周期为光照16 h—黑暗8 h，温度22～24 ℃，光照度为120 μmol/（m2·s）。

1.2.2 T-DNA插入突变体鉴定 采用表1中所示引物对突变体进行鉴定。T-DNA插入突变体appr6-4和appr6-5纯合体基因组DNA用自身基因RP引物与T-DNA序列LBa1引物可以扩增出特异条带，而LP+RP引物扩增不出条带；野生型或无插入植株基只有LP+RP引物能扩增出目的条带。PCR程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；之后72 ℃总延伸 10 min。

进一步对突变体的T-DNA序列插入位置进行分析。以突变体纯合体植株的基因组DNA为模板，用T-DNA序列左右端引物LBa1 5′-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3′、RBa1 5′-TGGTTCACGTAGTGGG CCATCG-3′分别与基因组序列两端引物RP、LP（表1）扩增，将所得目的扩增产物片段用凝胶回收试剂盒回收，之后重组到克隆载体上（pEASY-T1），送至北京Life Technologies测序并比对分析T-DNA插入位置。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测基因表达 采用通用植物总RNA提取试剂盒提取不同植物材料RNA，反转录后采用实时荧光定量PCR分析。所用的引物如表2所示。反应体系（10 μL）中加入SYBR Premix Ex Taq（2×）5 μL，正向引物与反向引物（20 μmol/L）各0.1 μL，cDNA 模板0.2 μL，ddH2O补至10 μL。每个反应体系重复3次，充分混匀，短暂离心后采用CFX96荧光定量PCR仪（Bio-Rad，美国）进行扩增。实时荧光定量PCR反应程序：95 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s读取荧光值并重复40个循环，95 ℃ 10s，65 ℃升温至95 ℃，每次上升0.5 ℃，每次5 s读取荧光值。数据分析：CT值为PCR反应荧光信号达到所设域值时对应的循环数，ΔCT为目的基因引物CT（APPR6）与内参引物CT（Actin）值之差，ΔΔCT为处理组与对照组ΔCT之差，以2-ΔΔCT衡量标准化后基因表达差异。

1.2.4 种子萌发试验 将适量拟南芥种子表面消毒后，播种在含有不同浓度（±） ABA的固体MS培养基上，经4 ℃左右低温处理2～3 d后将培养皿转移至光照培养箱中。种子萌发以种子露白作为记录标准，分别在不同时间点（12、24、36、48、60、72 h）记录不同基因型种子对应的萌发数量。按照公式“萌发率=萌发数/总数×100%”对萌发率数据进行统计分析。

1.2.5 幼苗萌发后生长试验 将适量拟南芥种子表面消毒后，播种在含有不同浓度（±）ABA的固体MS培养基上，经 4 ℃ 低温层积处理2～3 d后将培养皿转移至光照培养箱中，经适当生长天数（10 d）后观察记录幼苗生长状况。

2 结果与分析

2.1 突变体appr6-4和appr6-5的T-DNA插入位点鉴定

之前报道的T-DNA插入突变体SALK_045714（appr6-1）和SALK_091917（appr6-2）均插入拟南芥APPR6基因起始密码子下游1 435 bp，SALK_061950（appr6-3）插入拟南芥APPR6基因起始密码子下游1 449 bp，这几个突变体纯合体种子胚胎发育异常、不能正常萌发生长；在添加蔗糖的培养基上生长出的植株移入土中生长后，其株高与角果大小均显著小于野生型，生长严重滞后。

本研究选择APPR6另外2个T-DNA插入突变体SALK_078430（appr6-4）与SALK_005601（appr6-5）。appr6-4突变体中T-DNA插入APPR6基因启动子区，即起始密码子ATG上游第271 bp到第254 bp之间，插入造成约18 bp碱基缺失；appr6-5突变体中T-DNA插入APPR6基因起始密码子ATG下游1539 bp到终止密码子TGA下游37 bp 之间，插入造成约52 bp碱基缺失（图1）。

同时，与野生型相比，appr6-4和appr6-5突变体的纯合体种子形态与野生型接近，并能够正常萌发，在土中可继续生长；进入生殖生长阶段，仅appr6-5在早期（35 d前）表现出株高（花序高度）较低、生长滞后，然而在42 d后appr6-4和appr6-5突变体与野生型相比植株高度差异不显著（图2）。因此选择appr6-4和appr6-5突变体作为遗传材料进行后续研究。

2.2 APPR6基因表达在种子中最高并受到ABA诱导

首先检测了拟南芥不同生长时期APPR6表达变化情况（图3-A）。采用实时荧光定量PCR检测野生型低温层积处理3 d后生长24 h种子、生长12 d幼苗和21 d幼苗中APPR6基因表达情况，发现APPR6在种子中表达量显著上调。在基因表达数据公共网站Arabidopsis eFP Browser（http：//bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi）（图3-C）以及Genevestigator（http：//www.genevestigator.com）（图3-D）查找生物芯片检测相关数据，发现APPR6在不同组织、器官中均有表达，并在种子中表达量最高。这些数据与图2-A中试验结果基本一致。

进一步检测了ABA处理后APPR6基因表达变化，结果图3-B表明。施加不同浓度（±） ABA（0、1、3 μmol/L）低温处理3 d后生长24 h的野生型Col种子中，APPR6表达随ABA浓度升高而显著升高。

2.3 APPR6调控种子萌发对ABA的响应

植物种子休眠与萌发过程受到ABA的调控，外源ABA会在一定程度上抑制种子的正常萌发过程。为研究APPR6在种子萌发过程中对ABA敏感性的影响，采用ABA诱导的种子萌发抑制试验检测不同基因型种子在萌发过程中对ABA敏感性的差异。用ABA信号转导负调节子编码基因ABI1与ABI2双突变体abi1-3 abi2-2作为对ABA敏感的对照，将野生型Col、突变体appr6-4和appr6-5、双突变体abi1-3 abi2-2的种子播种在无ABA（0 μmol/L）以及含有（±）ABA（05、1 μmol/L）的MS培养基上，经4 ℃低温处理约3 d后放入光照培养箱中正常生长，计算其在12 ～72 h的萌发率，统计结果如图4所示。在不含ABA的MS培养基上，野生型Col、appr6-4和appr6-5突变体种子在生长36 h后萌发率均可达到100%。而在含有不同浓度（±） ABA（05、1 μmol/L）的MS培养基上，与野生型Col相比，appr6-4和appr6-5突变体的萌发率受到ABA显著抑制，其超敏程度低于双突变体abi1-3 abi2-2。

2.4 APPR6调控幼苗早期生长对ABA的响应

高浓度ABA能够抑制植物幼苗生长。为研究APPR6对幼苗早期生长过程中对ABA敏感性的影响，采用ABA诱导的萌发后生长抑制试验检测不同基因型幼苗早期生长过程中对ABA敏感性的差异。用ABA信号转导负调节子编码基因ABI1与ABI2双突变体abi1-3 abi2-2作为对ABA敏感的对照。

将不同基因型种子直接播种在无ABA（0 μmol/L）以及含有不同浓度（±） ABA的MS培养基上，经4 ℃低温处理约3 d后放入光照培养箱中正常生长10 d，结果如图5所示。在无ABA（0 μmol/L）培养基上，除appr6-5根长略短、表现出显著生长滞后外，其他基因型植物根长差异不显著。在含有0.3 μmol/L ABA的MS培养基上，appr6-5突变体的子叶不能变绿伸展、胚轴与根部生长受到ABA显著抑制，appr6-4尽管超敏程度低于appr6-5突变体，但根系生长受到ABA抑制程度显著高于野生型（图5-A、图5-B）。在0.5 μmol/L ABA的MS培养基上，appr6-4受到ABA抑制程度仍显著高于野生型，appr6-5突变体的生长状态与双突变体abi1-3 abi2-2接近（图5-A、图5-B）。为排除appr6-5根长生长滞后的影响，以无ABA（0 μmol/L）培养基上根长数值为参照，将不同材料根长换算为相对值（图5-C），其结果与图 5-B中根长变化趋势一致。

3 结论与讨论

本研究首次发现拟南芥线粒体PPR蛋白APPR6参与ABA调控种子萌发与幼苗生长。在种子中APPR6的表达量最高，且受到外源ABA诱导。利用APPR6的另外2个可以完成整个生命周期的T-DNA插入突变体appr6-4和appr6-5作为遗传材料，发现在种子萌发与萌发后幼苗生长过程中，与野生型相比，突变体appr6-4和appr6-5均表现出显著的对ABA敏感的表型。这些证据表明APPR6参与ABA信号转导。

拟南芥APPR6在玉米中的同源蛋白是线粒体PPR蛋白MPPR6（MAGIv4_67802），主要在种子中表达，参与促进玉米线粒体中编码核糖体蛋白S3的rps3 mRNA 5′端成熟以及翻译起始，并影响胚胎发育；MPPR6在不同物种中结构域功能的保守性较高，可恢复拟南芥appr6-3突变体的生长滞后表型[21]。APPR6以及MPPR6主要在种子中表达与其在种子阶段的关键作用密切相关。

同时，在正常生长条件下，appr6-4（SALK_078430）的生长发育状态与野生型差异不显著，而appr6-5（SALK_005601）在早期幼苗生长过程中以及生殖生长初期表现出发育滞后表型；并且在萌发后生长过程中，appr6-5对ABA的超敏程度显著高于appr6-4。然而这2个突变体均能正常完成整个生命周期，纯合体种子外观与野生型差异不显著。根据APPR6的结构特征[21]，之前报道的纯合体致死、 胚胎发育发生严重异常的突变体株系SALK_045714（appr6-1）、SALK_091917（appr6-2）和SALK_061950（appr6-3）的 T-DNA 插入拟南芥APPR6基因的区段对应APPR6蛋白PPR结构域。突变体appr6-4的T-DNA插入在APPR6启动子区，其基因全长序列未受到影响；而appr6-5的T-DNA插入位点对应APPR6蛋白C端远离PPR结构域的位置。这表明APPR6中PPR结构域的完整性对其正常行使功能至关重要。

本研究为进一步阐明线粒体PPR蛋白的作用机制以及ABA信号网络提供了新的信息。进一步对拟南芥APPR6可能结合的RNA靶标进行筛选，并研究其表达变化对ABA信号转导关键调节基因表达的影响，有助于理解其可能的作用机制。此外由于ABA是重要的抗逆激素，对APPR6在干旱、盐、低温、渗透胁迫等主要非生物逆境中的功能有待后续鉴定。

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