汤珊珊，张治芬，刘文华，黄哲人，魏双双



17β-雌二醇对去势大鼠神经系统的作用

汤珊珊，张治芬，刘文华，黄哲人，魏双双

【摘要】目的：研究补充外源性雌激素对去势大鼠海马和皮质组织中核转录因子2/血红素加氧酶1（Nrf2/HO-1）、沉默信息调节因子相关酶1（SIRT1）表达含量及大鼠海马和皮质区域神经元排列形态和数量的影响，探讨雌激素对神经系统的作用。方法：选取清洁级3个月龄Sprague-Dawley（SD）雌性大鼠40只，随机分为4组。空白组（CON组）、假手术组（SHAM组）、去势对照组（OVX组）、去势实验组（OVX+E2组），每组10只。OVX+E2组给予17β-雌二醇（E2）灌胃，其余3组予生理盐水灌胃。16周后测定各组大鼠海马和皮质组织中的Nrf2、HO-1、SIRT1表达量，同时对大脑皮质及海马CA1区域神经元行形态学检查。结果：①OVX组大鼠海马及皮质中Nrf2、HO-1水平高于SHAM组，SIRT1水平低于SHAM组；OVX+E2组大鼠海马及皮质中Nrf2、SIRT1水平高于OVX组，HO-1水平则低于OVX组；②OVX+E2组海马及皮质组织中神经元数量及排列情况与SHAM组无明显差异，而OVX组海马及皮质尼氏体数量减少，神经元排列紊乱。结论：补充外源性雌激素可下调去势大鼠海马及皮质中HO-1表达，上调Nrf2、SIRT1表达，维持神经元数量及排列结构，从而保护神经系统。

【关键词】雌激素类；血红素氧化酶（脱环）；转录因子；沉默信息调节因子相关酶1；神经系统

作者单位：310006杭州，南京医科大学附属杭州医院妇产科

（J Int Obstet Gynecol，2016,43：107-110）

血红素加氧酶1（HO-1）的分子质量为32 ku的氧化应激蛋白，是血红素分解代谢过程中的限速酶。HO-1将血红素分解为一氧化碳（carbon monoxide，CO）、铁离子（Fe2+）和胆绿素，胆绿素随之被还原酶还原成胆红素[1]。HO-1的表达主要受核转录因子2 （Nrf2）调控。目前研究发现，HO-1及其终产物广泛参与机体内抗氧化反应，特别在神经系统，HO-1可中和活性氧堆积产生的毒性作用，抑制神经系统炎性因子表达[2]。沉默信息调节因子相关酶1（SIRT1）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的去乙酰化酶，在代谢、氧化应激、衰老等生理进程中发挥重要作用。在机体或细胞受到氧化应激或炎症损伤时，SIRT1表达增加从而保护机体或细胞[3]。研究发现SIRT1通过抗凋亡、缓解炎症反应、抑制氧化损伤等方式降低了脑血管事件的发病风险。目前研究认为，雌激素除作用于生长发育及性别分化，还可减少神经元损伤，缓解神经退行性疾病的发生[4]。但雌激素是否可通过调节Nrf2、HO-1及SIRT1表达改善神经元结构，从而维持神经系统正常生理功能，尚未明确。本研究旨在研究去势大鼠补充外源性雌激素后海马及皮质组织的Nrf2、HO-1、SIRT1表达量改变，以及神经元数量和排列形态变化，探讨雌激素对神经系统的保护作用。

1　对象与方法

1.1实验动物选取SPF级3个月龄雌性SD大鼠40只，体质量180～220 g，由浙江省医学科学院动物中心提供。大鼠饲养于屏障动物室，室温维持在（22±2）℃，湿度50%±10%，光照时间昼夜交替比为12 h∶12 h，普通饲料喂养，自由进水。

1.2实验分组40只大鼠随机分为空白对照组（CON组）、假手术组（SHAM组）、去势对照组（OVX组）、去势实验组（OVX+E2组），每组10只。适应性喂养1周后，OVX组、OVX+ E2组予切除双侧卵巢，SHAM组予切除腹部等量脂肪组织，CON组未予处理。每周称量大鼠体质量，每日灌胃。OVX+E2组予17β雌二醇（E2）0.2 mg/（kg·d）灌胃，CON组、SHAM组和OVX组予等量0.9%生理盐水灌胃。

1.3指标测定灌胃16周，大鼠称质量后予10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉取血，经3 500 r/min离心10 min，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定血清E2、卵泡刺激素（FSH）水平。大鼠从枕骨大孔处断头，剥离脑组织经天平称质量，计算脑质量/体质量比值。随后行①形态学检查：取一侧大脑半球的脑组织用10%甲醛固定后Nissl染色，光镜下随机选取海马CA1区域及皮质区域6个高倍镜视野下观察神经元数量及排列结构，免疫组化方法测定海马及皮质中Nrf2/HO-1水平；②指标测定：另一侧大脑半球分离出海马组织磨成匀浆，蛋白质印迹（Western blotting）法测定海马组织中HO-1表达水平。

1.4统计学方法采用SPSS19.0软件进行统计分析。定量数据用均数±标准差（x±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较，方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Tamhance检验。采用Image pro-plus 6.0软件分析免疫组化图片，计算各组相对水平。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.14组大鼠灌胃后E2、FSH水平比较OVX组大鼠E2水平低于CON组、SHAM组和OVX+E2组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。OVX组大鼠FSH水平高于CON组、SHAM组和OVX+E2组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表14　组大鼠灌胃16周后E2和FSH水平　（±s）

表14　组大鼠灌胃16周后E2和FSH水平　（±s）

注：a与CON组比较P＜0.05，b与SHAM组比较P＜0.05，c与OVX组比较P＜0.05。表2～4同。

组别　n　E2（ng/L）　FSH（IU/L）CON组　10　36.072±6.867　6.055±1.107 SHAM组　10　33.693±10.068　4.934±1.440 OVX组　10　19.411±4.056ab　11.410±2.939abOVX+E2组　10　37.814±4.085c　6.312±1.397cF（P）　18.314（＜0.001）　24.846（＜0.001）

2.24组大鼠脑质量、脑质量/体质量比值比较4组间脑质量差异无统计学意义（P＞0.05）。OVX组大鼠脑质量/体质量比值低于CON组、SHAM组和OVX+E2组差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

表24　组大鼠灌胃16周后脑质量、脑质量/体质量比值比较（±s）

表24　组大鼠灌胃16周后脑质量、脑质量/体质量比值比较（±s）

组别　n　脑质量（g）　脑质量/体质量比值CON组　10　2.030±0.125　0.593±0.043 SHAM组　10　1.956±0.151　0.582±0.053 OVX组　10　1.892±0.250　0.497±0.043abOVX+E2组　10　2.027±0.127　0.551±0.031cF（P）　1.039（0.386）　10.316（＜0.001）

2.34组大鼠海马及皮质Nrf2、HO-1表达水平比较免疫组化结果提示OVX+E2组Nrf2表达水平高于其他3组，而OVX组HO-1高于其他3组。见表3和图1（见后插三）。Western blotting复测海马中HO-1表达水平，见图2。

图2　Western blotting测大鼠海马HO-1蛋白的表达

2.44组大鼠海马及皮质中SIRT1表达水平比较OVX组海马及皮质中SIRT1表达水平均低于其他3组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

2.54组大鼠海马CA1区及皮质区病理切片结果与CON组CA1区神经元相比，SHAM组神经元排列稍疏松，胞浆内尼氏体清晰；OVX组细胞核固缩伴核深染，尼氏体减少，轮廓模糊；OVX+E2组细胞间隙增大，尼氏体略少。与CON组皮质神经元相比，SHAM组无明显区别，OVX组尼氏体轮廓模糊，OVX+E2组尼氏体略模糊。见图3（见后插三）。

表34　组大鼠灌胃后海马及皮质Nrf2、HO-1相对水平　（±s）

表34　组大鼠灌胃后海马及皮质Nrf2、HO-1相对水平　（±s）

组别　海马Nrf2　海马HO-1　皮质Nrf2　皮质HO-1 CON组　1 152.163±176.261　19.094±4.968　305.215±53.795　15.207±2.024 SHAM组　1 792.060±42.100a　17.773±4.269　443.043±47.091　14.527±2.936 OVX组　3 125.459±169.578ab　358.000±71.411ab　1 188.645±35.380ab　241.038±78.485abOVX+E2组　4 576.990±109.568abc　160.131±21.428abc　4 137.715±510.397c　86.914±13.186abcF（P）　751．973（＜0．001）　110．656（＜0．001）　287．715（＜0．001）　42．999（＜0．001）

表44　组大鼠灌胃后海马及皮质SIRT1相对水平（±s）

表44　组大鼠灌胃后海马及皮质SIRT1相对水平（±s）

组别　n　海马SIRT1　皮质SIRT1 CON组　10　867.765±45.115　979.536±58.184 SHAM组　10　840.908±43.912　941.176±50.795 OVX组　10　735.578±29.496ab　835.148±62.059abOVX+E2组　10　814.778±38.542c　989.230±24.242cF（P）　18．314（＜0．001）　9．564（＜0．001）

3　讨论

自然绝经或手术切除双侧卵巢造成体内长期低雌激素状态后，神经系统会随之发生病理学改变，如神经元细胞死亡、神经突触损伤、炎症激活等[5]。本实验设计了摘除双侧卵巢模拟大鼠更年期的模型，发现外源性补充雌激素下调去势大鼠海马及皮质区HO-1水平，上调Nrf2及SIRT1水平，维持海马及皮质区神经元数量及排列结构稳定，从而保护神经系统。

HO-1作为抗氧化蛋白酶，广泛参与体内抗氧化反应和细胞内抗炎过程[6]。HO-1及其分解代谢产物一氧化碳、铁离子和胆绿素，可中和细胞内堆积的氧自由基[7]，减轻细胞氧化损伤程度。本实验免疫组化法和Western blotting结果均证实去势手术后长期低雌激素状态诱导大鼠海马及皮质区HO-1高表达。低雌激素状态加速大脑老化，而衰老过程伴随着氧化应激增加，故海马及皮质中HO-1激活可能是其发挥抗氧化活性、代偿性保护神经系统的结果。外源性补充雌激素后，去势大鼠氧化应激损伤减轻，HO-1表达下降。Kireev等[8]提出去势大鼠补充雌激素后肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β等炎症因子显著降低，提示雌激素对HO-1的作用可能与下调炎症因子有关。去势实验组体内雌激素水平高于对照组，而HO-1表达略高于对照组，可能系外源性激素活性低于机体自身，有待进一步研究。

核转录因子Nrf2是调节HO-1表达的最重要的分子。生理条件下，Nrf2与Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）联结存在于细胞质中[9]。当外界刺激破坏Nrf2-Keap1复合体后，Nrf2转移至细胞核中与抗氧化反应元件（ARE）结合，随后诱导HO-1释放[10]。本实验发现去势大鼠补充雌激素后，海马及皮质中Nrf2表达水平增加，表明17β-E2增加Nrf2核转录并联结于细胞质ARE的过程。这与细胞实验发现雌激素处理后增加细胞Nrf2转录的结论是相似的[11]。但本实验未发现雌激素上调去势大鼠HO-1表达，提示雌激素对HO-1的调节，可能涉及机体内其他内源性调节机制。也有学者发现雌激素上调Nrf2及HO-1表达[11-12]，相关研究主要集中在细胞学实验。目前尚未见去势大鼠实验与细胞学实验结合讨论雌激素调节HO-1表达的相关文献，有待进一步研究。

SIRT1属于去NAD+依赖性去乙酰化酶家族，在平衡DNA的修复重组、维持染色体稳定性和基因转录过程中发挥重要作用[13]。当受到炎症损伤或能量限制时，SIRT1表达增加，减少氧化损伤，维持线粒体正常功能[14]，从而保护机体或细胞。本实验及团队[15]共同证实17β-E2上调去势大鼠SIRT1水平。同时也观察到去势大鼠SIRT1低表达伴随大脑尼氏体数量少，神经细胞排列紊乱。而补充雌激素后SIRT1高表达，尼氏体结构清晰，数量增加。本实验虽未讨论SIRT1表达量与尼氏体结构的关联，但有研究发现大鼠出现神经元结构紊乱、突触可塑性缺陷，记忆和空间学习能力受损与SIRT1表达量下降有关[16]。此外，动物实验[17]和细胞实验[18]均表明，SIRT1诱导Nrf2表达，并促进Nrf2在细胞核内与ARE联结，激活Nrf2下游蛋白释放。但本研究中未阐述Nrf2与SIRT1之间的作用关系，值得进一步研究。

目前研究认为，雌激素主要通过抗氧化和抗凋亡的作用保护神经系统。本实验是国内至今首次探讨外源性补充雌激素对去势大鼠大脑Nrf2、HO-1 及SIRT1表达及神经元形态的影响，更多机制有待深入研究。

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[本文编辑王昕]

The Effects of 17β-Oestradiol on the Nervous System of Ovariectomized Rats

TANG Shan-shan，ZHANG Zhi-fen，LIU Wen-hua，HUANG Zhe-ren，WEI Shuang-shuang.Department of Obstetrics and Gynecology，The Affiliated Hangzhou Hospital of Nanjing Medical University，Hangzhou 310006，China
Corresponding author：ZHANG Zhi-fen，E-mail：Zhangzf@zju.edu.cn

【Abstract】Objective：Investigate the effects of exogenous estrogen on the expression of nuclear transcription factor （Nrf2），heme oxygenase-1（HO-1），silent information regulator 1（SIRT1），and the changes of the neuronal morphology and volume in the hippocampus and cortex of those ovariectomized rats，so as to explore the beneficial effects of estrogen on the nervous system.Methods：Forty female Sprague-Dawley（SD）rats aged three months were randomly divided as follows：①control group（CON），②sham operation group（SHAM），③ovariectomized group（OVX），④treated group（OVX+E2）.There were 10 rats in each group.The OVX+E2group were treated with 17β-oestradiol intragastric administration，the other groups were given saline daily.After 16 weeks，Nrf2/HO-1 and SIRT1 levels in the hippocampus and cortex were detected by immunohistochemistry.Then observe the morphology of neurons from cerebral cortex and hippocampus CA1 region.Results：①Compared with the SHAM group，the Nrf2/HO-1 level in hippocampus and cortex of the OVX group was significantly increased，while SIRT1 level was significantly decreased；Compared with the OVX group，Nrf2 and SIRT1 level of the OVX+E2group was significantly increased，while HO-1 level was significantly decreased.②There were not significant differences in the number and arrangement of neurons between OVX+E2group and SHAM group，and the number of tigroid body in hippocampus and cortex of the OVX group was reduced，the morphological alteration of the neuron were disordered.Conclusions：Exogenous oestradiol increased the Nrf2/SIRT1 level but reduced HO-1 level in the hippocampus and cortex of the ovariectomized rats，maintaining neuronal number and structure，thereby protecting the nervous system.

【Keywords】Estrogens；Heme oxygenase(decyclizing)；Transcription factors；Silent information regulator 1；Nervous system

基金项目：国家卫生计生委科学研究基金-浙江省医药卫生重大科技计划（WKJ-ZJ-024）；杭州市医药卫生科技计划（重大）项目（2011Z003）；杭州市科技局重点项目（20120533Q04）

通信作者：张治芬，E-mail：Zhangzf@zju.edu.cn

收稿日期：（2015-08-31）