张敏娜,罗声栋，胡　燕，貌盼勇△

(中国人民解放军第三○二医院:1.感染性疾病诊疗与研究中心；2.临床研究管理中心，北京 100039)



·论著·

人上皮细胞黏附分子的真核表达及鉴定

张敏娜1,罗声栋2，胡燕2，貌盼勇2△

(中国人民解放军第三○二医院:1.感染性疾病诊疗与研究中心；2.临床研究管理中心，北京 100039)

摘要:目的构建人上皮细胞黏附分子(EpCAM)全基因的真核表达质粒，研究其在HepG2细胞中的表达。方法将EpCAM 基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-EpCAM，转染人肝癌HepG2细胞。通过免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测对转染后细胞内EpCAM蛋白的表达进行鉴定。结果双酶切鉴定结果表明重组质粒构建成功。免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测结果一致表明，转染后EpCAM基因在HepG2细胞中表达成功。结论成功构建了人EpCAM 的真核表达载体，并在HepG2细胞中表达，为研究高表达人EpCAM的肝癌细胞的功能打下基础。

关键词:人上皮细胞黏附分子；真核表达；载体

人上皮细胞黏附分子(EpCAM) 是最早在结肠癌中发现的一种跨膜糖蛋白，也是第一个用单克隆抗体技术鉴定出来的人肿瘤相关抗原[1]。EpCAM 广泛表达于上皮来源的正常组织[2]，并在多种上皮源性癌组织中不同程度的过表达[3]。已被多项研究证实与肿瘤的诊断和预后密切相关。在肝细胞癌中，虽然EpCAM 表达率较低，但由于近年来的研究认为EpCAM 为肝癌干细胞标记，而受到越来越多的关注[4]。本研究对人肝细胞癌组织来源的EpCAM 全基因序列在肝癌细胞系中进行了真核表达研究，为探讨高表达EpCAM的肝癌细胞功能打下基础。

1材料与方法

1.1材料EpCAM RNA 由本院行肝癌切除术患者的肝癌组织中提取。HepG2细胞由医院临床研究管理中心保存。逆转录试剂盒(SuperScriptⅢ Reverse Transcriptase)、转染试剂盒(LipofectamineTM2000)、RIPA裂解液均购自Invitrogen公司。DNA片段纯化试剂盒(EasyPure Quick Gel Extration Kit)、Anti-his 鼠单克隆抗体、 FITC标记羊抗鼠-IgG抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG 抗体、Trans1-T1感受态细胞均购于全式金公司。鼠抗人EpCAM单克隆抗体MOC-31(EpCAM细胞外结构域抗体)购自AbD Serotec 公司，兔抗人Ep-ICD单克隆抗体(EpCAM细胞内结构域抗体)购自Abcam 公司，anti-EpCAM-PE抗体购自BD公司。限制性核酸内切酶KpnⅠ、XbaⅠ购自NEB公司。质粒中量提取试剂盒购自Qiagen 公司。

1.2引物合成根据GenBank 数据库中提交的EpCAM基因序列(ID：DQ891338)设计两对引物，对EpCAM 全基因序列进行巢式PCR扩增。外引物正向序列5′-3′：TCC CGC GCC CCT CTT CTC，反向序列5′-3′：ATT TGC TAT TTC CCT TCT TCT，用于第1轮PCR扩增。内引物正向序列5′-3′：GGT ACC ATG TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAC TAC GCT GCG CCC CCG CAG GTC CT，添加KpnⅠ酶切位点及HA-tag序列，反向序列5′-3′：TCT AGA TTA ATG GTG ATG GTG ATG ATG TGC ATT GAG TTC CCT AT，添加 XbaⅠ酶切位点及His-tag序列，用于第2轮PCR扩增。扩增产物预计大小为1 002 bp，按照pcDNA3.1(+) 载体进行翻译，可用His-tag及HA-tag抗体进行蛋白表达鉴定。

1.3EpCAM基因的扩增将肝癌组织提取的RNA逆转录为cDNA(操作过程严格按照试剂盒说明书)。以EpCAM cDNA为模板,用合成的内、外两对引物进行巢式PCR扩增。第一轮扩增反应体系：5×TransStart FastPu DNA聚合酶缓冲液 10 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，上游外引物2 μL，下游外引物2 μL，5×TransStart FastPu DNA聚合酶1 μL，EpCAM cDNA 1 μL，dH2O 30 μL。反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，扩增30个循环；72 ℃ 延伸5 min。第2轮扩增反应体系：5×TransStart FastPu DNA聚合酶缓冲液10 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，上游内引物2 μL，下游内引物2 μL，5×TransStart FastPu DNA聚合酶 1 μL，第1轮PCR产物 1 μL，dH2O 30 μL。反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，扩增2个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，扩增2个循环；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，扩增22个循环；72 ℃ 延伸5 min。将琼脂糖凝胶电泳鉴定正确的EpCAM基因序列连接到平末端载体pEASY-Blunt Simple，转化至Trans1-T1 感受态细胞，扩增培养单克隆菌落并提取质粒。PCR及酶切鉴定正确的重组质粒送Sangon Biotech公司测序。

1.4EpCAM真核表达载体的构建用限制性核酸内切酶KpnⅠ和XbaⅠ同时酶切测序正确的重组质粒及真核表达载体pcDNA3.1(+)，胶回收纯化目的片段。连接反应体系：10×T4 DNA连接酶缓冲液 10 mmol/LATP 1 μL，pcDNA3.1(+)酶切片段 1 μL，重组质粒酶切片段7 μL，T4 DNA连接酶1 μL。连接反应条件：25 ℃连接反应1 h，16 ℃过夜。转化至Trans1-T1感受态细胞，扩增培养单克隆菌落并提取质粒，将酶切鉴定及测序均正确的重组质粒命名为pcDNA3.1(+)-EpCAM。中提质粒，应用紫外分光光度计检测质粒的浓度，备转染用。

1.5重组质粒pcDNA3.1(+)-EpCAM转染HepG2细胞HepG2细胞用含有10%胎牛血清、1% 非必需氨基酸及双抗(链霉素+青霉素)的DMEM 培养基于37 ℃、5% CO2的培养箱中传代培养。将对数生长期的细胞接种于六孔板，待细胞贴壁生长密度达70%～80%时，换无抗菌药物培养液。按照质粒质量与转染试剂体积2∶5的比例对其进行转染，用Opti-MEM (每孔250 μL)稀释转染试剂(每孔10 μL)，混匀后静置5 min；Opti-MEM(每孔250 μL)稀释质粒(每孔4 μg)；转染试剂稀释液与质粒稀释液混匀后静置20 min后加入六孔板培养液中。于37 ℃培养6 h后更换为含抗菌药物的DMEM 全培养液，37 ℃继续培养。

1.6间接免疫荧光转染前1 d于六孔板中放入无菌盖玻片,将胰酶消化的HepG2细胞铺于六孔板。转染pcDNA3.1(+)-EpCAM质粒的HepG2 细胞继续于37 ℃孵育24～48 h，至细胞长至单层密度约90%，将细胞玻片取出，PBS洗片，冷丙酮固定，晾干。取制备好的细胞片置于载玻片上，放置于黑色湿盒内，PBS洗片；拟行抗-EpICD染色的细胞片加0.1% Trixon 100 破膜处理5 min，PBS洗片；加5%牛血清白蛋白封闭30 min；分别加一抗：抗-his鼠单克隆抗体(浓度1∶200)或鼠抗人EpCAM单克隆抗体MOC-31(浓度1∶200)或兔抗人抗-EpICD抗体(浓度1∶200)，4 ℃孵育过夜；洗片后加FITC标记山羊抗鼠单抗(浓度1∶200)、伊文蓝衬染胞核，湿盒内室温避光孵育40 min；PBS洗片后用10%甘油封片。于荧光显微镜下观察拍照。

1.7Western Blotting检测EpCAM真核表达蛋白收集转染pcDNA3.1(+)-EpCAM质粒24及48 h后的HepG2细胞，用RIPA裂解液冰上裂解细胞，加入蛋白上样液，煮沸5 min，12 000 g 离心5 min，取上清进行SDS-PAGE电泳；转膜及脱脂牛奶封闭后，加兔抗人抗-EpICD抗体(浓度1∶5 000)，4 ℃孵育过夜。用PBST洗膜，加HRP标记羊抗兔IgG(浓度1∶3 000)，室温孵育1 h，PBST洗膜后显影成像。

1.8流式细胞仪检测HepG2细胞EpCAM表达率收集转染pcDNA3.1(+)-EpCAM质粒48 h的HepG2细胞；PBS洗细胞2次；100 μL PBS重悬后加入抗-EpCAM-PE抗体，室温避光染色20 min；PBS洗细胞2次；用200 μLPBS重悬细胞，流式细胞仪检测。

2结果

2.1EpCAM基因扩增电泳结果经巢式PCR 扩增后，1%琼脂糖凝胶电泳分析显示1条约1 000 bp 的DNA片段，与预计条带大小相符，见图1。测序分析后与Genbank中EpCAM基因(ID：DQ891338)ORF 序列比对，完全一致，表明EpCAM 基因扩增成功。

泳道1：Trans2K Plus Ⅱ DNA标记物；泳道2：EpCAM 基因扩增产物。

图1EpCAM 基因的扩增

2.2EpCAM真核表达质粒的酶切鉴定结果用KpnⅠ和XbaⅠ酶切重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-EpCAM，电泳结果显示大小约5.4 kbp和1 000 bp的两条DNA条带,其中5.4 kbp的条带为载体pcDNA3.1(+)，1 000 bp的条带为插入的EpCAM基因,均与预计大小相符,表明EpCAM基因重组真核表达质粒构建成功,酶切电泳图见图2。

泳道1：Trans2K Plus Ⅱ DNA标记物；泳道2：EpCAM重组质粒的酶切产物。

图2重组真核表达质粒的酶切分析

2.3pcDNA3.1(+)-EpCAM质粒转染HepG2细胞的免疫荧光检测结果 荧光显微镜下观察到成功转染入pcDNA3.1(+)-EpCAM质粒的HepG2细胞，经EpCAM胞外域抗体(MOC-31)、胞内域抗体(抗-EpICD)、抗-His抗体染色均可于胞浆见翠绿色荧光。对照组HepG2细胞呈暗红色，未见荧光。见图3(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

2.4Western Blotting检测EpCAM表达的结果pcDNA3.1(+)-EpCAM质粒转染入HepG2细胞的蛋白提取物进行SDS-PAGE电泳，Western Blotting结果显示转染重组质粒24 h及48 h后的细胞蛋白样品均在约40×103处出现目的条带，提示EpCAM融合蛋白的成功表达，并验证了所表达蛋白的抗原活性。如图4所示。

1.EpCAM蛋白阳性对照(EpCAM原核表达融合蛋白)；2.转染pcDNA3.1(+)-EpCAM质粒24 h后的蛋白样品；3.转染48 h后；4.阴性对照(HepG2细胞蛋白样品)。

图4Western Blotting分析EpCAM真核表达

蛋白的特异性

2.5流式细胞仪检测HepG2细胞EpCAM阳性率的结果未转染质粒的HepG2细胞EpCAM阳性细胞率0.6%，转染pcDNA3.1(+)-EpCAM重组质粒后EpCAM阳性细胞率升高到20.2%。见图5(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

3讨论

EpCAM为Ⅰ型跨膜糖蛋白，相对分子质量约为40×103，由314个氨基酸构成，分子结构包括：细胞外结构域(EpEX)、单次跨膜结构域和细胞内结构域(EpICD)。EpCAM 可介导非Ca2+依赖性同源细胞间的黏附，促进细胞周期和细胞增殖[5]，并与肿瘤的发生、进展、侵袭及转移等相关[6]。近年来，EpCAM被多项研究证实为肿瘤干细胞标记。由于EpCAM 是目前表达最强和最广泛的肿瘤抗原之一,可能成为大多数上皮源性肿瘤免疫治疗的靶点。目前，EpCAM 抗体对于结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等的治疗主要还处于临床试验阶段。已经在德国上市的鼠来源抗EpCAM 单克隆抗体Edrecolomab(ED) 是第一个用于治疗人类胃肠道肿瘤并显示出延长整体生存期的临床疗效的单克隆抗体[7-8]。EpCAM 双特异性抗体Catumaxomab 也于2009年被欧盟委员会批准应用于EpCAM 表达阳性肿瘤患者的恶性腹水的治疗，并显示出仅次于上皮癌的明确的临床获益[9]。在肝细胞癌方面，近年研究认为EpCAM 为肝癌干细胞标记物，EpCAM表达阳性的肝癌细胞也同时表达其他肝干细胞标记，具备自我更新和分化能力及较高的侵袭性,能够在NOD/SCID 小鼠(非肥胖糖尿病严重联合免疫缺陷小鼠)中诱生高侵袭性的肝癌[10]。但对于EpCAM在肝癌中的作用机制及未来可能的诊疗方面的应用还有待于进一步研究。本研究为最大程度地模拟表达EpCAM的肝癌细胞的生物学行为，选择HepG2细胞系作为EpCAM的真核表达细胞。前期流式细胞仪及细胞免疫荧光检测均显示其EpCAM天然表达率很低。HepG2细胞转染EpCAM真核表达重组质粒后，应用EpCAM特异性胞外域、胞内域抗体及抗-His标签抗体行免疫荧光检测，均观察到表达EpCAM蛋白的细胞胞浆翠绿色荧光染色；Western Blotting分析显示转染真核表达质粒的细胞蛋白样品呈现EpCAM的特异性条带；流式细胞仪检测显示，转染后的HepG2细胞EpCAM阳性率显著升高。以上结果均表明EpCAM重组质粒真核表达成功，与原核表达系统相比，真核表达产物更接近于天然分子的构象，为研究EpCAM表达阳性的肝癌细胞的生物学行为奠定了基础。

参考文献

[1]Herlyn M,Steplewski Z,Herlyn D,et al.Colorectal carcinoma-specific antigen:detection by means of monoclonal antibodies[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1979,76(3):1438-1442.

[2]Winter MJ,Nagtegaal ID,Van Krieken JH,et al.The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology[J].Am J Pathol,2003,163(6):2139-2148.

[3]Went PT,Lugli A,Meier S.et al.Frequent EpCAM protein expression in human carcinomas[J].Hum Pathol,2004,35(1),122-128.

[4]Gires O,Klein CA,Baeuerle PA.On the abundance of EpCAM on cancer stem cells[J].Nat Rev Cancer，2009,9(2):143.

[5]Münz M,Kieu C,Mack B,et al.The carcinoma-associated antigen EpCAM upregulates c-myc and induces cell proliferation[J].Oncogene,2004,23(34):5748-5758.

[6]Balzar M,Winter MJ,de Boer CJ,et al.The biology of the 17-1A antigen (EpCAM)[J].J Mol Med,1999,77(10):699-712.

[7]Sears HF,Atkinson B,Mattis J,et al.Phase-Ⅰ clinical trial of monoclonal antibody in treatment of gastrointestinal tumours[J].Lancet,1982,1(8275):762-765.

[8]Riethmüller G,Schneider-Gädicke E,Schlimok G,et al.Randomised trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes′ C colorectal carcinoma[J].Lancet,1994,343(8907):1177-1183.

[9]Heiss MM,Murawa P,Koralewski P,et al.The trifunctional antibody catumaxomab for the treatment of malignant ascites due to epithelial cancer:results of a prospective randomized phase Ⅱ/Ⅲ trial[J].Int J Cancer,2010,127(9):2209-2221.

[10]Yamashita T,Ji J,Budhu A,et al.EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features[J].Gastroenterology,2009,136(3):1012-1024.

Expression and identification of human EpCAM eukaryotic recombinant plasmid

ZhangMinna1,LuoShengdong2,HuYan2,MaoPanyong2△

(1.TreatmentandResearchCenterforInfectiousDiseases;2.ResearchCenterforClinicalMedicine,the302HospitalofPLA,Beijing100039,China)

Abstract:ObjectiveTo construct human EpCAM eukaryotic recombinant plasmid,and to study the expression of EpCAM protein in HepG2 cells.MethodsThe recombinant plasmid,named pcDNA3.1(+)-EpCAMwas constructed by cloning EpCAM gene into eukaryotic vector pcDNA3.1(+).Then HepG2 cells were transfected with EpCAMrecombinant plasmid.The eukaryotic expression of EpCAM protein was verified by immunofluorescence，Western Blotting and flow cytometry.ResultsThe construction of EpCAM recombinant eukaryotic plasmid was identified by restriction enzyme digestion.The results of immunofluorescence,Western Blotting,and flow cytometry consistently indicated that EpCAM protein were successfully expressed in HepG2 cells.ConclusionHuman EpCAM eukaryotic vector is constructed and EpCAM protein could be expressed well in HepG2 cells,which laid a foundation for further research on the function ofhepatocarcinoma cells highly expressing EpCAM.

Key words:epithelia cell adhesion molecule;eukaryotic expression;vector

(收稿日期：2016-01-02)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.028

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)09-1223-03

作者简介：张敏娜，女，主治医师，主要从事感染性疾病诊疗研究。△通讯作者，E-mail:maopy302@163.com。