龙娜，李瑾，蔡博宇，肖克林，高亮，李慧，易红，李晓红

·论著·

复发性流产患者种植窗期血清雌、孕激素水平和子宫内膜端粒酶的表达

龙娜，李瑾，蔡博宇，肖克林，高亮，李慧，易红，李晓红

【摘要】目的：分析复发性流产（RSA）患者种植窗期血清雌、孕激素水平和子宫内膜端粒酶的表达，探讨RSA病理生理学机制。方法：选择2014年6月—2015年3月在深圳市宝安区妇幼保健院就诊的RSA患者32例及正常妊娠女性25例作为研究对象，采用宫腔镜检查、化学发光法、免疫组化法和实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法，分别检测种植窗期宫腔及子宫内膜形态、血清雌二醇（E2）、孕酮（P）水平以及子宫内膜中端粒酶含量。结果：①RSA患者中，宫腔镜下表现为差型子宫内膜者（腺体开口小或内膜血管呈点状或片状分布，严重者内膜呈鸡蛋壳状，未见明显血管及腺体）占56.3%，腺体与间质反应不同步者占40.6%；在正常妊娠组中，表现为佳型子宫内膜者（腺体开口大，极度扩张呈指环状，且内膜血管丰富呈网状分布）占84%，腺体与间质反应同步者占88%，2组比较差异有统计学意义（均P＜0.05）。②种植窗期端粒酶活性与E2/P比值呈线性相关（r=0.947 5），RSA组种植窗期子宫内膜端粒酶活性较正常妊娠组明显增强（P＜0.05）。③2组种植窗期子宫内膜端粒酶在腺上皮细胞及间质细胞均有表达，在腺上皮细胞中表达差异无统计学意义（P＞0.05），在间质细胞中RSA组较正常妊娠组增强（P＜0.05）。结论：①种植窗期宫腔镜下子宫内膜形态有助于了解及初步判定RSA患者子宫内膜容受性，为查找病因提供依据。②种植窗期子宫内膜端粒酶活性失调可能与RSA有关。③种植窗期检测血清雌、孕激素及子宫内膜端粒酶活性有助于评价RSA患者的子宫内膜容受性，从而为改善及治疗RSA提供依据。

【关键词】流产，习惯性；子宫内膜；孕激素；端粒酶；种植窗

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：21-24，36）

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指与同一性伴侣连续3次及3次以上的自然流产，连续发生2次自然流产其再次流产的风险与3次自然流产相近[1]，发生率约1%～2%，其发生原因众多且混杂，公认的RSA原因包括染色体异常、代谢性疾病、高龄母亲、免疫性因素、子宫解剖异常和感染因素等，但仍有超过50%的患者未发现明确病因[2]。“种植窗”（window of implantation，WOI）是子宫内膜对胚胎接受性达到最佳的一种状态，通常为排卵后的6～8 d，仅维持48 h，在性激素调节下，种植窗期子宫内膜形态组织结构和分泌蛋白都发生一系列变化，且其活性表达受雌、孕激素水平调控。本研究拟从子宫内膜容受性细胞学机制探寻RSA的病因，研究采用宫腔镜检查、化学发光法、免疫组化法和实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法，分别检测种植窗期子宫内膜形态、血清雌二醇（E2）、孕酮（P）水平以及子宫内膜中端粒酶含量，进一步探讨RSA的诊治。

1　对象与方法

1.1研究对象选择2014年6月—2015年3月在深圳市宝安区妇幼保健院生殖科就诊有过2次及2次以上自然流产患者32例（RSA组），以及既往有过1次及以上正常妊娠女性25例（对照组）作为研究对象，2组平均年龄分别为（30.41±2.32）岁和（29.37±3.14）岁，差异无统计学意义（t=1.438 5，P＞0.05）。纳入标准：2组患者基础内分泌正常，月经周期规律且有排卵，周期26～32 d；超声监测子宫内膜未见明显异常回声；近3个月内否认任何激素类药物应用史及宫腔内手术操作史；排除传染病活动期等相关疾病；RSA组至少有2次及以上流产史，夫妻双方均完善RSA系统检查，明确排除由男方因素、女方解剖因素、免疫因素及染色体因素引起的流产；对照组有过1次或以上正常生育史者。本研究经我院伦理委员会审查，并取得钠入者签署的知情同意书。

1.2方法

1.2.1子宫内膜的获取2组患者均于月经第10天开始用尿黄体生成激素（LH）试纸检测，于高峰出现前来院行超声监测排卵并明确排卵日，于排卵后6～10 d来院行宫腔镜检查，采用国产4 mm纤维宫腔镜和德国Storz公司生产的影像系统，按Sakumoto等[3]的方法观察子宫体和底部内膜，最主要为后壁。根据子宫内膜腺体开口及血管网的形态学表现进行分型。差型：腺体开口小或内膜血管呈点状或片状分布，严重者内膜呈鸡蛋壳状，未见明显血管及腺体（见图1）；佳型：腺体开口大，极度扩张呈指环状，且内膜血管丰富呈网状分布（见图2）。术中用活检钳于宫底部钳取少许子宫内膜组织，分成2份，一份放入甲醛液中固定，石蜡包埋后用于免疫组化染色，另一份放入一次性无菌试管中，立即置入-70℃冰箱中用于端粒酶TRAP-PCR检测。

图1　差型子宫内膜

图2　佳型子宫内膜

1.2.2血清性激素测定宫腔镜检查当日抽取受检者清晨空腹外周静脉血3 mL，用于化学发光法测定血清中E2和P水平。

1.2.3子宫内膜组织中的端粒酶的检测采用免疫组化SP法检测，端粒酶的兔抗人多克隆抗体购自上海邦景公司。操作方法参考SP试剂盒说明书。光镜下观察，端粒酶为细胞浆染色，阳性染色为棕黄色。每张切片选用5个400倍视野，采用Bisosens Digital Imaging System图像分析仪和Image Pro Plus 5.0软件进行图像分析，测量端粒酶的阳性区光密度值，结果取平均值。

1.2.3.1子宫内膜组织制备将待测组织物50 mg在冰冻状态下以最快速度用研磨棒碾碎成粉末状，放进DOUNCE匀浆器震荡50 s，加入2～3 μL预冷的裂解液匀化80下，转移到1.5 mL离心管，放进冰槽里孵育30 min，4℃微型台式离心机离心10 min，速度为16 000×g（或13 000 r/min），小心移取上清液到新的无菌1.5 mL离心管，移取5 μL进行蛋白定量检测，并采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测RNA有无，提取的RNA立即进行端粒酶活性测定。

1.2.3.2端粒酶活性的检测采用端粒酶实时荧光定量PCR技术，反应体系总量为25 μL，移取15 μL反应液到0.5 mL PCR管中。加入4 μL待测的细胞裂解悬液（严格避免RNA污染），加入2.5 μL染色液,再加入3.5 μL补充液到总量25 μL，放进4℃微型台式离心机瞬时离心5 s,使用1 000 μL带滤芯枪头加入1滴封隔夜,即刻放入荧光定量PCR仪，TRAP实时定量检测试剂盒购自美国杰美基因大中华区销售总代理。反应条件如下：端粒延伸30℃20min，然后95℃预变性30s，60℃1.90 s，35个循环。采集数据进行分析，PCR产物置于-20℃保存备用。

1.3统计学方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。定性资料组间比较采用X2检验，定量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用两独立样本均数比较的t检验，各指标间关系采用Pearson相关分析。检验水准为α=0.05。

2　结果

2.1子宫内膜形态及反应情况种植窗期宫腔镜直视下RSA组子宫内膜形态为佳型内膜的患者比例低于对照组，病理学下内膜腺体与间质反应同步率也低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1　2组患者种植窗期子宫内膜形态及反应同步性比较例（%）

2.2端粒酶定量用标准品293细胞（人胚肾细胞，10 000，1 000，100和10的细胞数）作为阳性对照，以此建立标准曲线，见图3。将待测的标本按1.2.3.2步骤经实时荧光定量PCR扩增后得到S型扩增曲线及每个样本的循环数，即Ct值，见图4。将得到的Ct值代入标准曲线计算公式Y=mX+b，斜率（m）为-1.61，X为Ct值，Y轴截距（b）为42.13，计算Y值，即端粒酶的相对含量（表2中的TE）。举例如下：依据标准曲线图3中b为42.13, m为-1.61，X为26.15，得到Y值0.028 5。

图3　标准品293细胞建立的标准曲线

2.3种植窗期血清激素及子宫内膜端粒酶mRNA水平2组各项指标差异均有统计学意义，RSA组E2和E2/P以及TE均高于对照组，P水平低于对照组，见表2。TE含量与E2/P值呈线性正相关（r=0.947 5，t= 10.151，P=0.000 3）。

图4　端粒酶实时定量PCR扩增曲线

表2　2组患者种植窗期血清E2、P及子宫内膜组织中端粒酶mRNA表达比较　（±s）

表2　2组患者种植窗期血清E2、P及子宫内膜组织中端粒酶mRNA表达比较　（±s）

组别　n　E2(ng/mL) P（nmol/mL）　E2/P　TE RSA组　32 518.02±27.58 42.93±5.32 12.20±1.43 0.026 3±0.026对照组25 501.18±30.19 52.76±3.15 09.52±0.70 0.006 7±0.006 t 2.190　8.177　8.590　3.730 P 0.030　0.000　0.000　0.000

2.4种植窗期子宫内膜端粒酶免疫组化结果种植窗期子宫内膜内端粒酶在RSA组及对照组的腺上皮细胞及间质细胞均见表达，且2组腺上皮细胞中端粒酶表达含量差异无统计学意义，而间质细胞中的端粒酶表达差异有统计学意义，RSA组高于对照组，见表3。光镜下观察端粒酶为细胞质染色，箭头示腺上皮细胞及间质细胞的棕黄色染色，RSA组间质细胞表达较对照组明显。见图5。

表3　2组患者种植窗期子宫内膜端粒酶在腺上皮和间质表达的比较　（±s）

表3　2组患者种植窗期子宫内膜端粒酶在腺上皮和间质表达的比较　（±s）

组别　n　腺上皮细胞　间质细胞RSA组　32　1.44±0.23　0.61±0.14对照组　25　1.39±0.17　0.35±0.06 t 0.909　8.671 P 0.367　0.000

图5　端粒酶蛋白在种植窗期子宫内膜中腺上皮和间质细胞的表达（SP×400）

3　讨论

子宫内膜容受性是影响胚胎种植的重要因素，子宫内膜发育不良以及内膜对胚泡植入容受性的降低，可能是导致生育能力低下和不良妊娠结局的原因之一[4]。近年研究发现RSA女性较正常生育女性具有“超容受性”子宫内膜[5]，而这种“超容受性”子宫内膜引发了种植窗期的延伸，并降低了子宫内膜对优质胚胎选择的能力[6-7]，最终导致反复流产。

3.1种植窗期宫腔镜下子宫内膜形态与RSA的关系子宫内膜组织活检是评价子宫内膜形态的金标准，用于评价子宫内膜与胚胎是否同步，子宫内膜自身腺体与间质的发育是否同步，宫腔镜下种植窗期子宫内膜形态对于评价子宫内膜容受性具有较高的诊断价值[8]。佳型且同步发育的子宫内膜意味着内膜腺体分泌旺盛，血供丰富，内膜种植窗正好开放，有利于胚泡的种植及发育；而差型且不同步的子宫内膜则意味着腺体和血管发育不良，不适宜早期的胚胎着床及发育，导致不孕或早期流产[9-10]。本研究结果表明RSA组的子宫内膜差型多，不同步者多，说明子宫内膜容受性差，可能是导致RSA的原因。

3.2种植窗期血清雌、孕激素、子宫内膜端粒酶活性表达的相关性与子宫内膜容受性研究表明雌、孕激素是形成良好子宫内膜容受性的重要因素[11]，E2水平、E2/P比值的改变与子宫内膜容受性改变有关，E2低水平或高水平均对种植窗口期的开放产生影响[12]。子宫内膜端粒酶活性亦受雌、孕激素影响，E2浓度可直接影响人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA、端粒酶蛋白及外周血淋巴细胞端粒酶活性[13]。在整个月经周期中端粒酶活性表达不同，在增生期其与雌激素水平呈正相关，自分泌期开始与孕激素水平呈负相关，在种植窗期孕激素达高峰，此时端粒酶无表达或是低水平，这种变化有利于胚胎的种植[14]。本研究中，种植窗期RSA组子宫内膜端粒酶阳性表达率高于对照组，且表达量强，并与血清E2/P呈线性正相关（r=0.947 5）。因此，假设当在种植窗期子宫内膜端粒酶活性表达增强后，有可能引起种植窗延长，进而对子宫内膜的超容受性产生正向作用，或是在正常子宫内膜容受下，端粒酶活性的增加加速了胚胎细胞的异常增殖和分化，而最终导致流产。

3.3端粒酶活性在子宫内膜中的表达与流产在胚胎种植的过程中，囊胚通过黏附、穿透、种植等的一系列过程完成与母体子宫内膜之间的对话，这些环节中的任何一个小的缺陷，如细胞增殖异常、细胞死亡、生物化学因素等均会导致胚胎种植失衡，进而出现或发育不良的子宫内膜而导致胚胎无法发育或超容受性子宫内膜对异常胚胎的接受而最终流产[15]。在本研究中，2组患者的端粒酶在子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞均见表达，在腺上皮细胞中的表达较间质细胞相似，但在间质细胞中，正常对照组端粒酶表达量很低，RSA组患者端粒酶表达增强且失衡，而众多的研究表明，子宫内膜间质细胞是发生子宫内膜蜕膜化的基本，且其具有识别优质和劣质胚胎的功能[5-7]，因此，笔者推测在种植窗期子宫内膜中端粒酶活性表达增强及失衡可能与复发性流产有关。

在种植窗这一特定的时期，血清孕酮的峰值出现伴随着端粒酶活性暂时性消失是为了适应最大的子宫内膜容受性，此时端粒酶活性的消失在最大程度上降低那些与增殖作用有关的细胞分化，以利于胚胎着床及植入[14]。综上所述，种植窗期子宫内膜容受性的改变可能是引起RSA的重要原因之一，子宫内膜端粒酶活性表达失调与RSA有关，种植窗期血清雌、孕激素及子宫内膜端粒酶活性检测有助于评价及了解RSA患者的子宫内膜容受性，从而为改善及治疗RSA提供临床依据。

参考文献

[1]李倩，梁晓燕.内分泌异常与复发性流产[J].国际生殖健康/计划生育杂志，2013，32（5）：327-329.

[2]Rai R，Regan L．Recurrent miscarriage [J]．Lancet，2006，368 （9535）：601-611.

[3]Sakumoto T，Inafuku K，Miyara M，et al．Hysteroscopic assessment of midsecretory-phase endometrium, with special reference to the luteal-phase defect[J]．Horm Res，1992，37（Suppl 1）：48-52．

[4]叶彩云，杨雪峰.多囊卵巢综合征子宫内膜容受性的研究进展[J].国际妇产科学杂志，2012，39（5）：491-494

[5]Salker M，Teklenburg G，Molokhia M，et al．Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss [J]．PLoS One，2010，5（4）：e10287．

[6]Teklenburg G，Salker M，Heijnen C，et al．The molecular basis of recurrent pregnancy loss:impaired natural embryo selction [J]．Mol Hum Reprod，2010，16（12）：886-895.

[7]Weimar CH，Kavelaars A，Brosens JJ，et al．Endometrial stromal cells of women with recurrent miscarriage fail to discriminate between high- and low-quality human embryos [J]．PLoS One，2012，7（7）：e41424．

[8]Fadare O，Zheng W．Histologic dating of the endometrium: accuracy, reproducibility, and practical value[J]．Adv Anat Pathol，2005，12（2）：39-46．

[9]Masamoto H，Nakama K，Kanazawa K．Hysteroscopic appearance of the mid -secretory endometrium: relationship to early phase pregnancy outcome after implantation [J]．Hum Reprod，2000，15 （10）：2112-2118．

[10]李素春，冯苗，潘萍，等.不明原因不孕患者着床窗期子宫内膜容受性分析[J].中国实用妇科与产科杂志，2009，25（7）：507-510.

[11]徐苗厚,张振国,江森,等.黄体功能缺陷与子宫内膜效应不良患者的内分泌特征[J].中华妇产科杂志, 1997, 32（3）:141-144．

[12]Ma WG，Song H，Dash SK，et al．Estrogen is a critical determinant that specifies the duration of the window of uterine receptivity for implantation[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100（5）：2963-2968．

[13]Benko AL，Olsen NJ，Kovacs WJ．Estrogen and telomerase in human peripheral blood mononuclear cells[J]．Mol Cell Endocrinol，2012，364（1/2）：83-88．

[14]Williams CD，Boggess JF，LaMarque LR，et al．A prospective, randomized study of endometrial telomerase during the menstrual cycle[J]．J Clin Endocrinol Metab，2001，86（8）：3912-3917．

[15]Hapangama DK，Turner MA，Drury JA，et al．Endometrial telomerase shows specific expression patterns in different type of reproductive failure [J]．Reprod Biomed Online，2008，17（3）：416-424．

[本文编辑李淑杰]

·论著·

Levels of Serum Estrogen and Progesterone and Expression of Endometrial Telomerase in RSA Patients

at Implantation Window

LONG Na，LI Jin，CAI Bo-yu，XIAO Ke-lin，GAO Liang，LI Hui，YI Hong，LI Xiao-

hong.
Department of Reproductive Health，Shenzhen Baoan Maternal and Child Health Hospital，School of Medicine, Jinan University, Shenzhen 518100，Guangdong Province，China
Corresponding author：LONG Na，E-mail：summer_long@126.com

【Abstract】Objective：To investigate the levels of sera estrogen and progesterone, and the expression level of endometrial telomerase, in those recurrent spontaneous abortion（RSA）patients in the window of implantation (WOI), so as to explore the pathophysiology of RSA. Methods：The endometrial samples were collected from 32 cases of RSA and 25 cases of normal pregnant women with the informed consent. The levels of sera estrogen and progesterone were tested by chemiluminescence. The endometrial morphology was checked by hysteroscopy. The expression level of endometrial telomerase the time of WOI was tested by immunohistochemistry and real-time PCR. Results：①56.3% patients of RAS had the so-called "bad type" endometrium under hysteroscopy, and 40.6% RSA patients had unsynchronous response in endometrial glands and stroma. In the control group, 84% women had the so-called "good type" endometrium, and 88% had synchronous response.②There was a linear correlation between the telomerase activity in the WOI and the E2/P ratio（r=0.947 5）. The telomerase activity in the RSA group was significantly higher than that in the control group（P＜0.05）.③The expression of telomerase was found in both the epithelial cells and the stromal cells in the WOI endometrium. There was no significant difference in the telomerase expression in the epithelial cells between two groups（P＞0.05）, while the expression in the stromal cells of the RSA group was significantly increased when compared with the control group（P＜0.05）. Conclusions：①The endometrial morphology in the WOI under hysteroscopy is helpful to understand the endometrial receptivity of RSA patients.②The disorder of endometrial telomerase activity in the WOI may be related to RSA.③The levels of serum estrogen and progesterone combined with the endometrial telomerase activity were used to evaluate the endometrial receptivity, which is benefit to improve the treatment of RSA.

【Keywords】Recurrent spontaneous abortion；Endometrium；Progesterone；Telomerase; Window of implantation

基金项目：2014年深圳市宝安区科技计划项目（2014075）

作者单位：518100广东省深圳市，暨南大学医学院附属宝安妇幼保健院生殖健康科

通信作者：龙娜，E-mail：summer_long@126.com

收稿日期：（2015-04-23）