史　婷，郝双利，张志琪

(药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，陕西师范大学化学化工学院，西安　710062)



扁杏仁肽对血管内皮功能的影响

史婷，郝双利，张志琪*

(药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，陕西师范大学化学化工学院，西安710062)

摘要：目的探究扁杏仁肽对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells， HUVECs)内皮功能的影响。方法体外培养HUVECs，以150，300和600 μg·mL-1不同剂量的扁杏仁全肽、扁杏仁谷蛋白肽给药，进行细胞生长增殖试验及细胞培养液中一氧化氮(NO)和内皮素(ET)含量的检测。结果细胞培养48 h后，与对照组相比，所有剂量的扁杏仁全肽和扁杏仁谷蛋白肽对HUVECs均有显著的抑制作用(P<0.01)，同时显著地减弱去甲肾上腺素对细胞增殖的促进作用(P<0.01)；在不同剂量扁杏仁全肽和扁杏仁谷蛋白肽干预下培养细胞48 h，与对照组相比，培养液中NO含量显著升高、ET含量显著降低(P<0.01)，同时对去甲肾上腺素具有显著的拮抗作用(P<0.01)。结论扁杏仁全肽特别是扁杏仁谷蛋白肽对血管内皮功能具有很强的保护作用。

关键词：扁杏仁全肽；扁杏仁谷蛋白肽；人脐静脉内皮细胞；内皮素；一氧化氮

血管内皮细胞是位于血管内表面的单层细胞，覆盖于整个血管系统的内表面[1]，它不仅为血液流动提供光滑的表面，还可调节血管张力，血管内皮功能障碍是高血压发生、发展的病理基础[2]。高血压患者因内皮细胞功能受损，导致一氧化氮(NO)释放减少，内皮素(ET)释放量增加[3-4]。已有报道，扁杏仁肽具有血管紧张素转移酶(ACE)抑制作用[5-6]，本研究采用扁杏仁肽对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作用，通过细胞增殖和测定释放一氧化氮(NO)、内皮素(ET)量，探讨其对血管内皮功能的影响，以期为扁杏仁降压肽药物的开发提供实验依据。

1仪器与试药

1.1仪器C-W10XB/22型倒置光学显微镜，1.0 R高速台式冷冻离心机(日本Nikon公司)；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台(苏州净化科技有限公司)；二氧化碳培养箱(Thermo公司)；细胞计数板(上海求精生化试剂仪器有限公司)；URIT-660型酶联免疫分析仪(大连优利特科技发展有限公司)。1.2试药扁杏仁全肽(以陕北扁杏仁为原料，提取蛋白，经复合蛋白酶Protamex和碱性内切酶Alcalase双酶水解获得)；扁杏仁谷蛋白肽(以扁杏仁谷蛋白为原料，经碱性内切酶Alcalase酶解、超滤过1K膜、冻干获得，经鉴定其对ACE 的IC50=96.03 μg·mL-1)；人脐静脉内皮细胞(西安交通大学医学院惠赠)。高糖DMEM(美国Gibco公司)；胎牛血清(兰州民海生物技术研究所)；二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮(MTT，美国Sigma公司)；胰蛋白酶(美国Amresco公司)；卡托普利(Cap)和去甲肾上腺素(NE)购于中国食品药品鉴定所；一氧化氮(NO)试剂盒(南京建成生物工程研究

所)；内皮素(ET)Elisa试剂盒(上海岚派生物科技有限公司)。

2实验方法

2.1HUVECs的培养按一般细胞培养方法接种、培养，培养液为高糖DMEM+20%胎牛血清，隔天更换培养液，待细胞生长融合长至覆盖瓶底80%～90%时，用胰酶消化法对细胞按1∶2的比例进行传代。

2.2实验分组及处理取对数生长期HUVECs，用PBS冲洗后，胰酶消化，制成 1×104个·mL-1或1×105个·mL-1细胞悬液，随机分为11组。(1)空白对照组：不加任何干预因素；(2)～(11)组为实验组，其中(2)～(4)为扁杏仁全肽实验组：低、中、高剂量扁杏仁全肽质量浓度分别为150，300和600 μg·mL-1；(5)～(7)为扁杏仁谷蛋白肽实验组：低、中、高剂量扁杏仁谷蛋白肽质量浓度分别为150，300和600 μg·mL-1；(8)为卡托普利阳性对照组(Cap组)：Cap浓度为10-5mol·L-1；(9)为去甲肾上腺素组(NE组)：NE质量浓度为100 μg·mL-1；(10)为扁杏仁全肽+NE组：扁杏仁全肽与NE质量浓度分别为300和100 μg·mL-1；(11)为扁杏仁谷蛋白肽+NE组：扁杏仁谷蛋白肽与NE质量浓度分别为300和100 μg·mL-1。

2.3MTT比色法测定细胞增殖将1×104个·mL-1细胞悬液，每孔100 μL接种于96孔板，在37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置培养。待细胞贴壁后，空白对照组加入100 μL高糖DMEM培养液；实验组(2)～(11)按分组要求分别加入同体积的不同干预因素。每组设6个复孔，分别继续培养24，48和72 h。培养结束后，每孔加入10 μL MTT溶液，继续孵育4 h，终止培养，吸弃培养液。每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物质充分溶解，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其吸光度(A)值，计算细胞增殖率。

细胞增殖率=实验组A值/空白对照组A值×100%

2.4NO和ET含量测定将1×105个·mL-1细胞悬液，每孔100 μL接种于96孔板培养，待细胞贴壁后，按分组要求分别加入不同干预因素，分别继续培养10，24和48 h，收集培养上清液，按试剂盒说明书测定NO和ET含量。

3实验结果

3.1扁杏仁肽对细胞增殖的影响在倒置相差显微镜下观察，空白对照组HUVECs接种后 6 h内，细胞基本伸展贴壁，呈现单层扁平状；12 h后HUVECs生长旺盛，多角形细胞显单层、铺路石状镶嵌排列，核分裂相多见，1～2个核仁，胞浆丰富；72 h后细胞融合达85%左右。用MTT染色后测定的细胞增殖率如表1所示。

表1扁杏仁肽对HUVECs相对增殖率(%)的影响

Tab. 1 Influence of almond peptide on the relative growth rate(%) of HUVECs

±s，n=6)

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与NE组比较△△P<0.01。

由表1可见，与空白对照组比较，细胞培养24 h后，除低剂量扁杏仁全肽的抑制生长作用不显著、中剂量扁杏仁全肽和低剂量扁杏仁谷蛋白肽抑制生长作用显著(P<0.05)外，卡托普利及其他剂量的扁杏仁全肽和扁杏仁谷蛋白肽对HUVECs均有极显著的抑制生长作用(P<0.01)；当细胞培养时间达48 h时，卡托普利及所有剂量的扁杏仁全肽和扁杏仁谷蛋白肽均对HUVECs有极显著的抑制作用(P<0.01)；去甲肾上腺素(NE组)可极显著地促进HUVECs生长，但与中剂量扁杏仁全肽或扁杏仁谷蛋白肽同时作用时，作用极显著地减弱(P<0.01)。

3.2扁杏仁肽对一氧化氮(NO)和内皮素(ET)含量的影响见表2。

表2扁杏仁肽对HUVECs培养液中NO含量(μmol·mL-1)的影响

Tab.2 Influence of almond peptide on the releasing NO of HUVECs

±s，n=6)

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与NE组比较△P<0.05，△△P<0.01。

与空白对照组比较，卡托普利及不同剂量的扁杏仁全肽、扁杏仁谷蛋白肽均可升高HUVECs培养液中NO含量、显著降低ET含量(P<0.01)，培养时间越长，作用越强；卡托普利和扁杏仁谷蛋白肽的作用明显强于扁杏仁全肽，见表2～3。

表3扁杏仁肽对HUVECs培养液中ET含量(pg·mL-1)的影响

Tab.3 Influence of almond peptide on the releasing ET of HUVECs

±s，n=6)

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与NE组比较△P<0.05，△△P<0.01。

实验结果显示，去甲肾上腺素(NE组)可极显著地降低HUVECs培养液中NO含量，促进ET分泌；中剂量扁杏仁全肽或扁杏仁谷蛋白肽对去甲肾上腺素具有显著的拮抗作用，中剂量扁杏仁谷蛋白肽与去甲肾上腺素合用，可使培养液中NO含量和ET值接近空白对照(P>0.05)。

4讨论

血管内皮细胞的重要功能之一是分泌血管舒缩活性物质，并借此来调节血管张力及血流量[7]。其中NO 是目前所知的最重要内皮舒张因子[2]；ET是内皮血管收缩因子，具有强大的血管收缩功能[8]。作为维持血管舒缩功能的重要活性物质，ET 和 NO 在正常情况下处于动态平衡[9]。内皮细胞损伤后，释放的很多活性物质如凝血酶、腺苷二磷酸、三磷酸腺苷、5-羟色胺等，破坏了自身调节体系平衡，使得 ET合成增多、 NO的合成和释放减少，导致血管张力调节紊乱，内皮依赖性舒张功能下降， 血管壁结构改变，导致血压升高[10]。本实验研究中，扁杏仁肽对HUVECs具有极显著地抑制生长作用，能够促进HUVECs分泌NO，减少ET分泌；同时，扁杏仁肽可减轻去甲肾上腺素(NE)引起的内皮细胞增殖，对去甲肾上腺素抑制NO分泌、促进ET分泌具有显著地拮抗作用。这些研究结果表明，扁杏仁肽对血管内皮功能具有保护作用，且具有与血管紧张素转化酶抑制剂类药物卡托普利相似的降压机制。这为扁杏仁肽特别是扁杏仁谷蛋白肽降压药物的开发和利用提供了参考依据。

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The protective effect of peptides derived from sweet almond on endothelial function

SHI Ting，HAO Shuangli，ZHANG Zhiqi*

(Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry，School of Chemistry and Chemical Engineering，Shaanxi Normal University，Xi′an 710062， China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of sweet almond peptides on the endothelial function of human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs). MethodsHUVECs were treated with different doses of the almond wholly peptides and the almond glutelin peptides (150，300 and 600 μg·mL-1)， and then the growth experiment of cells was carried out and the amount of NO and ET in culture media were measured.ResultsAlmond wholly peptides and the almond glutelin peptides could significantly inhibit the HUVEC growth， promote the NO releasing and reduce the ET level(P<0.01)，and significantly antagonize the effect of noradrenalin.ConclusionThe sweet almond peptides， especially the almond glutelin peptides， have strong protective action on the endothelial function of HUVECs.

Key words:sweet almond wholly peptides；almond glutelin peptides；human umbilical vein endothelium cells；endothelin；nitric oxide

(收稿日期：2015-10-14)

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1004-2407(2016)03-0267-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.014

*通信作者：张志琪，男，教授，博士生导师

作者简介：史婷，女，硕士研究生

基金项目：陕西省农业攻关项目(编号：2008K01-23)