李丹丹　汤响林　谭洪玲　梁乾德　王宇光　马增春　肖成荣　高月

[摘要]该研究采用磁悬浮3维（3D）培养技术建立了3D HepG2细胞评价模型，并应用此模型对典型的肝毒性药物进行了简单评价。HepG2细胞形成稳定3D结构后，采用免疫组化技术检测了HepG2细胞在2D，3D培养条件下的糖原储存能力，并应用RTPCR技术对比研究了HepG2细胞在2D，3D不同培养条件下Ⅰ相、Ⅱ相药物代谢酶、药物转运体、核受体及肝细胞特异标志性分子白蛋白（ALB）等相关基因的mRNA 表达水平。免疫组化结果显示，HepG2细胞在3D培养条件下具有丰富的糖原储存能力，此特性与人肝组织相类似。此外，在3D培养条件下，HepG2细胞绝大部分药物代谢酶、转运体、核受体及ALB的mRNA表达水平与2D相比均有不同程度的上调。在药物肝毒性评价方面，该实验选用了典型的肝毒性药物对乙酰氨基酚（APAP）和近年来肝毒性报道较多的中药何首乌Polygonum multiflorum Thunb及补骨脂Psoraleae corylifolia L进行单剂量和重复剂量（7 d）给药实验；在重复剂量给药实验中，3D HepG2细胞表现出更高的敏感性。应用磁悬浮3D培养技术建立的3D HepG2细胞模型无论在形态上还是功能上都更接近于人的肝组织，是较好的3D肝毒性评价模型。

[关键词]3D培养；肝毒性；评价模型

[Abstract]3D in vitro toxicity testing model was developed by magnetic levitation method for culture of the human hepatoma cell line HepG2 and applied to evaluate the drug hepatotoxicity After formation of stable 3D structure for HepG2 cells， their glycogen storage capacity under 2D and 3D culture conditions were detected by immunohistochemistry technology， and the mRNA expression levels of phase Ⅰ and Ⅱ drug metabolism enzymes， drug transporters， nuclear receptors and liverspecific marker albumin（ALB） were compared between 2D and 3D culture conditions by using RTPCR method Immunohistochemistry results showed that HepG2 cells had abundant glycogen storage capacity under 3D culture conditions， which was similar to human liver tissues The mRNA expression levels of major drug metabolism enzymes， drug transporters， nuclear receptors and ALB in HepG2 cells under 3D culture conditions were upregulated as compared with 2D culture conditions For drug hepatotoxicity evaluation， the typical hepatotoxic drug acetaminophen（APAP）， and most reported drugs Polygonum multiflorum Thunb（Chinese name Heshouwu） and Psoraleae corylifolia L（Chinese name Buguzhi） were selected for single dose and repeated dose（7 d） exposure In the repeated dose exposure test， 3D HepG2 cells showed higher sensitivity This established 3D HepG2 cells model with magnetic levitation 3D culture techniques was more close to the human liver tissues both in morphology and functions， so it was a better 3D hepatotoxicity evaluation model

[Key words]3D culture； hepatotoxicity； evaluation model

doi：10.4268/cjcmm20160725

近年来，中药在用于治疗各种疾病并取得确切疗效的同时，其所致毒性和不良反应事件亦频繁发生，而肝脏作为药物代谢的主要器官无疑是受药物损伤最严重的靶器官[1]。因此，中药的毒性研究，尤其是肝毒性研究受到广泛关注，寻找能够准确、快速、灵敏反映药物肝毒性的技术与模型已成为当前中药安全性评价亟待解决的重大问题。

传统2D培养的HepG2细胞无极化形态，低表达药物代谢酶和转运体，这也常被认为是限制其毒性预测能力的关键因素之一[2]。本研究采用由美国Nano3D Biosciences公司研发的磁悬浮3D培养技术，通过优化3D HepG2细胞单个球体的细胞数量、培养基体积及培养时间所建立的3D细胞模型，在保持肝细胞形态和功能上具有明显的优势，可应用于药物安全性评价和高通量筛选。

1材料与方法

11药物、试剂与仪器对乙酰氨基酚（日本TCI公司，CAS：103902）；生首乌（北京同仁堂，批号20120707）；补骨脂（北京同仁堂，批号20131008）；DMEM，PBS，胰酶（美国GIBCO公司）；胎牛血清（天津康源生物技术有限公司）；Trizol（美国Sigma公司）；引物合成（北京博迈德科技发展有限公司）；cDNA反转录试剂盒，RTPCR试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；CellTiterGlo荧光细胞活性检测试剂盒（美国Promega公司）；多聚甲醛（广东西陇化工股份有限公司）；糖原 PAS染色液试剂盒（上海瑞谷生物科技有限公司）；NanoShuttleTMPL磁纳米粒、96孔磁铁驱动（美国Nano3D公司）； T25细胞培养瓶、96孔普通培养板、96孔超低吸附培养板（美国Corning公司）；CO2培养箱（美国Thermo公司）；超微量分光光度计（美国GE公司）；StepOnePlus RTPCR System（美国Applied Biosystem公司）。

12药物制备精密称取生首乌（PM）适量，加10倍蒸馏水浸泡30 min后，煎煮2次，每次2 h；合并2次滤液并过滤，经旋转蒸发仪浓缩后，冷冻干燥成粉末。用培养基稀释所得粉末配成质量浓度为60 g·L-1的母液，过滤除菌，稀释至各给药浓度。

精密称取补骨脂（PC）适量，加10倍蒸馏水浸泡30 min后，煎煮2次，每次30 min；合并2次滤液，过滤、浓缩后，冷冻干燥成粉末。用培养基稀释所得粉末配成质量浓度为60 g·L-1的母液，过滤除菌，稀释至各给药浓度。

精密称取对乙酰氨基酚（APAP）适量，加入培养基配成浓度为30 μmol·L-1的母液，过滤除菌，用培养基稀释至各给药浓度。

133D HepG2细胞培养人肝癌HepG2细胞购自北京协和细胞库，生长于含10%胎牛血清的DMEM中，于37 ℃恒温、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。待细胞生长至80%汇合时加入NanoShuttleTMPL磁纳米粒37 ℃孵育过夜，使细胞磁化。次日将HepG2细胞接种于超低吸附的96孔板中，每孔约1×104个细胞，在96孔板顶部放置磁铁驱动，使细胞被吸引和聚集。HepG2细胞可在15 min内聚集成细胞团形成3D结构，此时可移去磁铁驱动。磁悬浮3D培养技术的具体操作流程见图1[3]。

14细胞免疫组化3D HepG2细胞培养24 h后，吸弃培养液并用PBS轻轻漂洗2次，用4%多聚甲醛室温固定20 min后进行糖原 PAS染色，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

15RNA提取和RTPCR分析Trizol法抽提总RNA，逆转录成cDNA，反应条件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。RTPCR所用引物序列见表1，反应程序：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。以GAPDH为内参，采用Livak（2-ΔΔCt）法进行相对基因表达分析。

16药物细胞毒性实验2D与3D HepG2细胞分别接种于普通与超低吸附的96孔板中，培养24 h后进行细胞毒性测试。给药24 h后，采用CellTiterGlo荧光细胞活性检测试剂盒检测细胞活性。此外，还对3D HepG2细胞进行了重复给药毒性实验，每隔24 h给药1次，重复给药1周。

17统计学方法实验数据以±s表示，使用SPSS 180软件进行统计处理，采用单因素方差分析，P<005为差异具有统计学意义。

2结果

213D HepG2细胞结构与功能接种于超低吸附96孔板中的HepG2细胞，在放置磁铁驱动15 min后即可形成紧密连接的3D球体结构，球体直径为1～2 mm，可持续培养1周以上。2D，3D HepG2细胞形态见图2。

222D与3D HepG2 细胞基因表达比较RTPCR结果显示，HepG2细胞在3D培养条件下绝大多数药物代谢酶、药物转运体及核受体的基因表达水平与2D相比均有不同程度的上调，见图4。其中I相药物代谢酶CYP3A4基因表达水平上升最为明显，约为2D培养时的59倍。药物转运体BSEP和MRP2是肝细胞毛细胆囊膜上主要的转运蛋白，在内外源物质转运方面发挥重要作用，它们在3D培养时基因表达量分别上升34，28倍。核受体中PXR上升最为显著，约为2D培养时的25倍。此外，肝细胞特异标志性分子白蛋白（ALB）在3D培养时基因表达量上升了35倍。

232D，3D HepG2细胞毒性研究通过比较2D，3D HepG2细胞单剂量和重复剂量给药细胞毒性试验，发现3D培养条件下的细胞对药物的反应更为敏感，见图5。当给以细胞单剂量、低浓度的APAP（009～188 μmol·L-1），PM（018～375 g·L-1）或PC（018～375 g·L-1）时，3D HepG2细胞球体的疏松程度、细胞形态及细胞活力均发生明显改变，而2D HepG2细胞并无此类明显变化；当给予3D HepG2细胞重复剂量（7 d）APAP或PM时，细胞对药物的敏感性明显增强：APAP重复剂量给药时的IC50 076 μmol·L-1显著小于单剂量给药时的541 μmol·L-1，PM重复剂量给药时的IC50 286 g·L-1显著小于单剂量给药时的1160 g·L-1， PC重复剂量给药时的IC50 369 g·L-1显著小于单剂量给药时的1471 g·L-1。

3讨论

肝脏是药物代谢的主体，肝实质细胞或肝细胞都含有多数药物代谢所需的酶和转运体，这些酶和转运体在药物代谢和毒性方面发挥着重要作用[2]。传统2D培养的细胞呈平面生长，缺少细胞与细胞、细胞与胞外基质间的接触，细胞极化现象消失，低表达药物代谢酶和转运体，这些都大大限制了其在药物安全性评价中的应用[2，4]。多种3D模型表明，细胞在3D培养条件下能较好的维持其极化状态和保持肝组织特有的功能[58]。由美国Nano3D Biosciences公司研发的磁悬浮3D培养技术是近年来新兴的一种3D培养技术，其主要原理是向2D 培养的细胞培养体系中加入由金纳米颗粒、氧化铁和细胞粘附多肽组成的磁性纳米颗粒使细胞磁化，通过外加磁场使细胞聚集成团后移除磁场，细胞便可在3D空间生长并分泌细胞外基质[9]。

本研究采用磁悬浮3D培养技术培养的人肝癌HepG2细胞与常规2D培养相比，不仅高表达绝大多数Ⅰ相、Ⅱ相药物代谢酶、药物转运体、核受体及肝细胞特异的标志性分子ALB，还具有丰富的糖原储存功能，与多数文献报道的3D肝细胞模型的特性相类似[58]。此外，因其能持续培养7 d以上，还可进行重复给药实验。在重复给药实验中，3D HepG2细胞对药物的敏感性显著提高。

中药具有多成分、多靶点、多途径的复杂作用特征，且临床病人服药周期从几周到几个月不等。常规2D培养的细胞仅能进行单次给药毒性实验，难以评估药物长期作用时的毒性大小；而采用磁悬浮3D培养技术培养的HepG2细胞可持续培养一周以上，进行多剂量重复给药实验，用于模拟药物长期低剂量使用时对人体肝细胞损伤的影响，与2D 细胞模型相比更符合中药临床的实际用药情况。

目前大多数3D细胞培养方法都要用到基质胶、聚合物支架等生物材料，这些方法往往费用昂贵，且3D细胞从培养到成型耗时近一个月，不利于大规模药物的快速筛选与毒性评价。磁悬浮3D培养技术与常规3D培养技术相比，3D细胞成型快（仅需1 d），操作简便，费用低廉，且细胞几小时之内就能形成紧密连接并自行分泌细胞外基质，是理想的药物毒性评价及高通量筛选模型。

[参考文献]

[1]黄幼异，孙蓉. 系统生物学技术用于中药肝毒性发现与评价的研究进展[J]. 中国药物警戒， 2013（10）：219.

[2]Ramaiahgari S C， den Braver M W， Herpers B， et al. A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liverlike properties for repeated dose highthroughput toxicity studies[J]. Arch Toxicol，2014，88（5）：1083.

[3]Tseng H， Balaoing L R， Grigoryan B， et al. A threedimensional coculture model of the aortic valve using magnetic levitation[J]. Acta Biomater， 2014（10）：173.

[4]李曼， 董延生， 李泽君， 等. 体外肝毒性评价细胞模型的研究进展[J]. 中国新药杂志， 2015（24）：1954.

[5]Gunness P， Mueller D， Shevchenko V， et al. 3D organotypic cultures of human HepaRG cells：a tool for in vitro toxicity studies [J]. Toxicol Sci， 2013， 133（1）：67.

[6]Takayama K， Kawabata K， Nagamoto Y， et al. 3D spheroid culture of hESC/hiPSCderived hepatocytelike cells for drug toxicity testing[J]. Biomaterials， 2013， 34（7）：1781.

[7]Kostadinova R， Boess F， Applegate D， et al. A longterm three dimensional liver coculture system for improved prediction of clinically relevant druginduced hepatotoxicity [J]. Toxicol Appl Pharmacol， 2013， 268（1）：1.

[8]Khetani S R，Bhatia S N. Microscale culture of human liver cells for drug development[J]. Nat Biotechnol， 2008， 26（1）：120.

[9]Haisler W L， Timm D M， Gage J A， et al. Threedimensional cell culturing by magnetic levitation[J]. Nat Protoc， 2013， 8（10）：1940.

[责任编辑曹阳阳]