何首乌肝毒性物质基础探索研究

2016-05-26杨敏刘婷冯伟红回连强李娆娆刘晓谦陈安家李春王智民

中国中药杂志 2016年7期

杨敏　刘婷　冯伟红　回连强　李娆娆　刘晓谦　陈安家　李春　王智民

[摘要]通过观察何首乌中蒽醌类成分对HepG2细胞的细胞毒作用，并通过精密肝切片技术对细胞毒成分进行验证，探讨何首乌致肝毒性的物质基础。运用MTT法检测何首乌中游离蒽醌、结合蒽醌及柰类共11个单体成分对HepG2细胞的毒性。将有明确细胞毒的成分与大鼠肝切片共同培养6 h后制备肝组织匀浆，通过BCA 法测定匀浆液中蛋白含量，连续监测法测定并计算每1 μg蛋白中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ谷氨酰氨基转肽酶（GGT）和乳酸脱氢酶（LDH）的漏出率，以考察这些成分对肝组织的毒性作用。细胞试验结果显示，只有大黄酸、大黄素、大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷和大黄素甲醚8O（6′O乙酰基）βD葡萄糖苷显示一定的细胞毒作用，其IC50分别为7107，12562，24227，40232 μmol·L-1，而其他7个化合物的毒性很小。肝切片试验结果显示，大黄酸400 μmol·L-1组能引起肝切片ALT，AST，LDH漏出率的显著升高（P<001），100 μmol·L-1组能引起肝切片 LDH漏出率的显著升高（P<005）；随药物浓度增大，肝切片中蛋白含量显著下降（P<005），显示有一定的量毒关系。大黄素400 μmol·L-1组可引起肝切片ALT，GGT，LDH漏出率的显著升高（P<001）。大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷800 μmol·L-1组能引起肝切片ALT，AST，LDH漏出率的显著升高（P<001或P<005），200 μmol·L-1组能引起肝切片LDH漏出率的显著升高（P<005）；且随药物浓度的增大肝切片中ALT，AST，LDH漏出率呈升高趋势，蛋白含量呈下降趋势。此外，浓度为800 μmol·L-1的大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷还可使肝切片MTT还原能力显著下降（P<001）。结果提示，大黄酸、大黄素及大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷只有在高浓度（≥400 μmol·L-1）时才可能对肝组织产生一定的损害作用。但是，据文献报道这3个成分的体内暴露水平都很低，要达到毒性浓度（400 μmol·L-1或800 μmol·L-1）的暴露水平，转化为健康成人至少分别需要单次口服4 898，339，5 581 g的何首乌药材，这与何首乌的临床使用剂量（生首乌3～6 g，制首乌6～12 g）相差甚远，因此，“蒽醌类成分是何首乌肝毒性成分”这一说法是缺乏科学依据的。

[关键词]何首乌；蒽醌类成分；肝细胞毒性；精密肝切片技术；肝毒性物质基础

[Abstract]By observing the cytotoxic effects of anthraquinones on HepG2 cell and using the precisioncut liver slices technique to authenticate the cytotoxic constituents， the paper aims to explore the material basis of Polygonum multiflorum root to cause liver toxicity Firstly， MTT method was used to detect the effect of 11 anthraquinone derivatives on HepG2 cell Then， the clear cytotoxic ingredients were cocultured with rat liver slices for 6h respectively， and the liver tissue homogenate was prepared BCA method was used to determine the content of protein in the homogenate and continuous monitoring method was used to monitor the leakage of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， gammaglutamine amino transpeptidase （GGT） and lactate dehydrogenase （LDH） The toxic effect of these ingredients on liver tissue was tested by calculating the leakage rate of the monitored enzymes As a result， rhein， emodin， physcion8OβDglucopyranoside and physcion8O（6′Oacetyl）βDglucopyranoside showed cytotoxic effects on HepG2 cell and their IC50 values were 7107， 12562， 24227， 40232 μmol·L-1 respectively， but the other 7 compounds are less toxic and their IC50 values can not be calculated The precisioncut liver slices tests showed that rhein group of 400 μmol·L-1 concentration significantly increased the leakage rate of ALT， AST and LDH （P<001）， and the rhein group of 100 μmol·L-1 concentration only increased the leakage rate of LDH （P<005） With the increase of rhein concentration， the protein content in liver slices decreased significantly （P<005） with a certain range of does Emodin group of 400 μmol·L-1 concentration significantly increased the leakage rate of ALT， GGT and LDH （P<001） Physcion8OβDglucopyranoside group of 800 μmol·L-1 concentration also significantly increased the leakage rate of ALT， AST and LDH （P<001 or P<005）， but the group of 200 μmol·L-1 concentration only significantly increased the LDH leakage （P<005） Along with the increase of the concentration of physcion8OβDglucopyranoside， the leakage rate of ALT， AST and LDH showed a trend of increase， but the protein content in liver slices was in decline Furthermore， MTT reduction ability of liver slices significantly decreased （P<001） in the physcion8OβDglucopyranoside group of 800 μmol·L-1 concentration The results suggested that rhein， emodin and physcion8OβDglucopyranoside at high concentrations （≥400 μmol·L-1） can produce some damage to the liver tissue However， the exposure levels of these constituents are very low， so to reach the toxic concentration （400 μmol·L-1 or 800 μmol·L-1） an adult of 65 kg body weight will need at least a single oral 4 898 g， 339 g and 5 581 g of Pmultiflorum root respectively， which is far from the statutory dose of crude P multiflorum root （36 g） or its processed product （612 g） Therefore， the conclusion that anthraquinones are the prime constituents of the hepatotoxicity of P multiflorum root are still not be proved

[Key words]Polygonum multiflorum root； anthraquinones； hepatoxicity； precisioncut liver slices technique； hepatoxic constituents

doi：10.4268/cjcmm20160721

何首乌始载于唐元和七年（公元813年）李翱《何首乌录》[1]，为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb的干燥块根，具有解毒、消痈、截疟、润肠通便、补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊降脂等功效[2]，在医疗、保健及美容方面应用极其广泛。近年来何首乌及相关制剂引起肝毒性的报道日益增多[37]，其安全性问题引起了广泛的关注。何首乌导致肝毒性的原因到底是外源性因素还是内源性因素，迄今尚无令人信服的结论。从内源性因素看，主流观点认为是其中的某些化学成分或其代谢物对肝细胞可能有一定毒性。文献报道显示，何首乌醇提物和水提物均可造成肝损伤[810]，且醇提物的毒性相对较大[1113]。何首乌中主要含有二苯乙烯苷类、蒽醌类及磷脂类等化学成分[14]。与水提物相比，醇提物中的蒽醌类成分较多[1516]；故而现阶段多认为“蒽醌致毒”[1719]，进而聚焦于游离蒽醌上，如大黄素、大黄酸作为主要贡献者[18]；用LCMS研究肝脏L02细胞对大黄素的摄取和蓄积时发现，大黄素可进入细胞质，并在细胞中蓄积之后产生毒性作用[19]；通过肝细胞凋亡发现，制首乌组及大黄酚组肝细胞凋亡指数与空白对照组比较有明显增加，从而得出大黄酚有可能是导致肝细胞凋亡的主要成分的结论[20]。

与上述结论矛盾的是，大量数据显示“生首乌毒性大于制首乌”[2123]，而制首乌中的游离蒽醌含量又远远高于生首乌，蒽醌苷却远远低于生首乌[24]；若“游离蒽醌致毒”的话，逻辑上制首乌的肝毒性应大于生首乌，与事实不符；再者，大黄的蒽醌含量远高于何首乌，为何其毒性较低，也侧面说明“游离蒽醌致毒”一说的依据不足。此外，虽有零星报道何首乌中结合蒽醌（大黄素8OβD葡萄糖苷[25]）对肝细胞的作用，但至今未见肝毒性报道，因此“蒽醌苷类致毒”一说也存在较大疑问。

为此，作者对何首乌主要蒽醌类成分进行细胞毒性筛选，通过观察游离蒽醌及其苷对HepG2细胞作用来筛选有肝细胞毒作用的成分，并从构毒关系上找出规律；再通过精密肝切片技术对有确切细胞毒的成分进行验证，以确认“蒽醌致毒”的真实性，为何首乌临床安全用药提供依据。

1材料

大黄酚，大黄酸，芦荟大黄素（中国食品药品检定研究院，批号分别为110796201017，110757200206，110795201007）；大黄酚8OβD葡萄糖苷，大黄素1OβD葡萄糖苷，决明酮8OβD葡萄糖苷（成都克洛玛生物科技有限公司，批号分别为150114，141211，150302）；大黄素甲醚（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号D00414072）；大黄素，大黄素8OβD葡萄糖苷，大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷，大黄素甲醚8O（6′O乙酰基）βD葡萄糖苷由本实验室自制获得，通过NMR和MS鉴定其结构，HPLC检测其纯度均大于98%。化学结构见图1。

MEM培养液（美国Gibco公司，LotNo 1707776）；胎牛血清（FBS）（美国Gibco 公司，Lot No 1414426）；DMEM培养液（美国 Gibco公司，LotNo 8115143）；025% TrypsinEDTA（美国Gibco 公司，LotNo 1638591）；PBS（Solarbio公司，LotNo 20150408）；二甲基亚砜（DMSO）和MTT为Solarbio公司产品。天门冬氨酸氨基转移酶试剂盒、丙氨酸氨基转移酶试剂盒、乳酸脱氢酶试剂盒、γ谷氨酰氨基转肽酶试剂盒（北京万泰德瑞诊断技术有限公司，批号分别为GG5101A，GG5104A，XJ5105B，GG5103A）；琼脂糖（英国OXOID limited 公司，批号84867402）；BCA法微量蛋白测试盒（南京建成生物工程研究所，批号20151204）。

Thermo Varioskan Flash多功能酶标仪，HERA Cell CO2培养箱（德国），超净工作台（北京冠鹏净化设备有限责任公司）；BCD286超低温冰箱（博西华家用电器有限公司）；Startorious BT125D电子分析天平（赛多利斯科学仪器）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；纯水仪（美国Millipore公司）；DSZ5000x倒置生物显微镜（北京中显恒业仪器仪表有限公司）；低速离心机（上海手术器械厂）；1000 Plus Vibracome 振荡切片机（英国），Thermo Varioskan Flash多功能酶标仪（美国），东芝TBA40FR全自动生化分析仪。

HepG2 细胞（人肝癌细胞）购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。

SD大鼠，雄性，体重180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号 SCXK（京）20120001。

2方法

21细胞毒性试验

211药品配制分别精密称取大黄素27 mg，芦荟大黄素 27 mg，大黄酚25 mg，大黄素甲醚28 mg，大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷45 mg，大黄素甲醚8O（6′O乙酰基）βD葡萄糖苷49 mg，大黄素1OβD葡萄糖苷43 mg，大黄酸28 mg，大黄素8OβD葡萄糖苷43 mg，大黄酚8OβD葡萄糖苷42 mg，决明酮8OβD葡萄糖苷41 mg，各加入二甲基亚砜（DMSO）100 μL 溶解，备用。在无菌、避光条件下将配好的母液用含10% FBS的MEM培养液稀释成所需浓度，分别装入灭菌后的 EP管中，混匀。其中，大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷、大黄素甲醚8O（6′O乙酰基）βD葡萄糖苷、大黄素1OβD葡萄糖苷7个成分的母液经倍比稀释后分别配制成浓度为400，100，25，625 μmol·L-1的样品溶液进行测定。大黄酸、大黄素8OβD葡萄糖苷、大黄酚8OβD葡萄糖苷和决明酮8OβD葡萄糖苷4个成分的母液经倍比稀释后分别配制成浓度为400，100，25，625，156，039 μmol·L-1的样品溶液进行测定。以上样品溶液中DMSO的终浓度均为04%。

212细胞培养HepG2细胞用含10% FBS的MEM培养液置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养，倒置显微镜下观察细胞生长至近融合状态时采用消化法传代。传代时，倒掉旧的培养基，再用MEM洗1～2次，加入025% TrypsinEDTA 1 mL，消化大约3 min，倒置显微镜下观察，待细胞相互分离，胞质回缩，胞体变圆后，立即加含血清培养基2～3 mL终止消化，用弯头吸管按部位轻轻吹打使细胞完全脱离瓶壁，最后将吸管尖部置于瓶底一角上下吹打数次，形成细胞悬液。再将细胞悬液转移到离心管，500 r·min-1离心5 min，离心完毕，弃上清液，再加入完全培养基吹匀，将细胞悬液分装至 2～3个新培养瓶中，置培养箱内继续培养。

213MTT法检测药物对细胞的毒性作用胰酶消化处于对数期的HepG2细胞，终止消化后离心，收集细胞将其制成悬液，细胞计数调整其浓度至2×105个/mL，接种于 96 孔板中，每孔加入200 μL细胞混悬液，置 37 ℃，5% CO2的培养箱中培养至细胞单层铺满孔底。然后将96孔板中的培养液吸走，加入不同浓度的药物（每一浓度设 4 个复孔，每孔加入药液150 μL ），同时设置空白组（加含10% FBS的MEM培养液）及对照组（加含04% DMSO的10% FBS 的MEM培养基）。置 37 ℃，5% CO2的培养箱中培养48 h 后取出 96 孔板，吸弃剩余培养液，每孔加入50 μL MTT溶液，继续培养4 h后将上清液去掉，每孔加入200 μL DMSO，低速振荡10 min，酶标仪570 nm 波长下测吸收度（A），计算细胞生长抑制率。抑制率=（A对照组-A实验组）/A对照组×100%。

22采用大鼠精密肝切片考察3个成分的体外肝毒性

将 SD 大鼠断头处死，在无菌条件下取出肝脏，按文献方法制备肝切片[26]，切片厚度为200 μm。将含大黄酸25，100，400 μmol·L-1，大黄素25，100，400 μmol·L-1及大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷50，200，800 μmol·L-1的DMEM 培养液分别与肝切片共同培养于24孔板中，肝切片1片/孔，在 37 ℃，5% CO2培养箱中分别培养6 h 。

221MTT还原能力培养6 h后取出培养板，弃去上清液，每孔加 1 g·L-1 MTT 1 mL，37 ℃ 振荡孵育 1 h，弃上清，每片肝切片再加1 mL DMSO，37 ℃振荡溶解1 h，上清 570 nm 处测A，肝切片称重，计算A除以肝切片质量（g）。

222生化指标肝切片用生理盐水制成10%的肝组织匀浆液，参照试剂盒说明书 BCA 法测定蛋白含量，全自动生化分析仪连续监测法测定上清液及肝切片匀浆液中ALT，AST，GGT，LDH活性，BCA 蛋白分析法测定上述匀浆液中的蛋白含量，按文献[26]方法计算每1 μg蛋白中ALT，AST，GGT，LDH的漏出率。

23统计学处理

所有实验数据用±s表示，采用SPSS 180 软件做t检验， IC50采用Probit回归拟合。P<005为有显著性差异，P<001为有极显著性差异。

3结果

31细胞毒性试验

何首乌中11个单体成分对HepG2细胞的细胞毒实验结果见表1，2。结果显示，只有大黄酸、大黄素、大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷、大黄素甲醚8O（6′O乙酰基）βD葡萄糖苷对HepG2细胞具有一定的细胞毒作用，而其他化合物的细胞毒作用则很小，无法计算出IC50；而且有的化合物如大黄素1OβD葡萄糖苷则对HepG2细胞的增殖起促进作用；此外，大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素8OβD葡萄糖苷和大黄酚8OβD葡萄糖苷高浓度时对HepG2细胞表现为抑制作用，而低浓度时则对细胞生长有促进作用，这一点与文献报道结果相吻合[1718， 27]。

32精密肝切片试验

大黄酸25，100，400 μmol·L-1与肝切片共培养 6 h 后，400 μmol·L-1组能引起肝切片ALT，AST，LDH漏出率的显著升高（P<001），100 μmol·L-1能引起肝切片 LDH漏出率的显著升高（P<005）；随药物浓度增大，蛋白含量显著下降（P<005），且显示一定的量毒关系。大黄素25，100，400 μmol·L-1与肝切片共培养 6 h 后，400 μmol·L-1组可引起肝切片ALT，GGT，LDH漏出率的显著升高（P<001）。大黄酸和大黄素对肝切片MTT还原能力均无明显影响。大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷50，200，800 μmol·L-1与肝切片共培养6 h 后，800 μmol·L-1能引起肝切片ALT，AST，LDH漏出率的显著升高（P<001或P<005）；200 μmol·L-1能引起肝切片LDH漏出率的显著升高（P<005），且随药物浓度的增大肝切片ALT，AST，LDH漏出率呈升高趋势，蛋白含量呈下降趋势。浓度为800 μmol·L-1的大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷与肝切片共培养6 h后MTT还原能力显著下降（P<001），见表3。

4讨论

近年来，何首乌的肝毒性问题已引起了世界各国广泛的关注，而探究其毒性物质基础成了学术界关注的焦点。本研究就这一焦点问题进行了探讨。

何首乌中主要含有二苯乙烯苷类和蒽醌衍生物两大类成分。本实验所研究的11个化合物都有从何首乌中分离得到的文献报道[14]，并且其中的10个蒽醌单体被认为是何首乌中的主要蒽醌类成分[28]。

HepG2 细胞来源于人肝胚细胞瘤，其所含的生物转化代谢酶与人正常肝实质细胞具有同源性，其分化程度较高，并且保留了较完整且活性稳定的生物转化代谢酶，是研究药物肝毒性常用的细胞模型之一[2930]。与蒽醌类化合物比较，决明酮8OβD葡萄糖苷对HepG2细胞基本无毒，据此推测具有蒽醌类母核的化合物更易产生细胞毒性。

游离蒽醌成苷后肝细胞毒作用到底是增大还是减少不能一概而论，还需要具体化合物具体分析。与大黄素相比，大黄素8OβD葡萄糖苷和大黄素1OβD葡萄糖苷的肝细胞毒性明显降低，而且成苷位置不同，其对细胞的影响也不同：大黄素R4位OH成苷后，肝细胞毒性有所降低；但当R1位成苷时，其对HepG2细胞不仅没有抑制作用，反而可以促进细胞的增殖。与大黄酚相比，同等浓度下大黄酚8OβD葡萄糖苷的肝细胞毒性也有所降低。但是，与大黄素甲醚相比，大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷和大黄素甲醚8O（6′O乙酰基）βD葡萄糖苷对HepG2细胞的毒性则均有所增加。

11 个化合物中，大黄酸的毒性相对最强，而这11个化合物中只有大黄酸R2位上有羧基，因此推测羧基的存在可大大增强蒽醌母核的肝细胞毒性。

大黄素、大黄素甲醚和大黄酚三者的结构只有R3取代基有差别，而它们对 HepG2细胞的毒性为大黄素>大黄素甲醚≈大黄酚，由此说明就对肝细胞毒性而言，取代基对蒽醌类化合物的细胞毒性贡献由大到小依次为OH>H≈OCH3。此外，大黄酸、大黄酚及芦荟大黄素结构上只有R2取代基不同，其对HepG2细胞的毒性由大到小依次为大黄酸>大黄酚>芦荟大黄素，由此推测蒽醌化合物中取代基对HepG2细胞的细胞毒作用影响由大到小为COOH>CH3>CH2OH。文献通过比较大黄酸和芦荟大黄素的活性，得出R2位取代基吸电子能力越强，对人肝癌细胞抑制作用越强的结论[31]。本实验结果表明吸电子官能团对蒽醌类化合物的肝毒性有一定影响，但并不完全符合该规律。

此外，细胞毒实验结果显示：大黄酸和大黄素对HepG2细胞的毒性最强，其次为大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷和大黄素甲醚8O（6′O乙酰基）βD葡萄糖苷，这4个化合物对HepG2细胞的抑制作用均随浓度的增高而增大，且在高浓度作用下有明显的细胞毒作用。而大黄素、大黄酸、大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷的毒性相对较强，因此，作者采用精密肝切片技术对这3个成分的肝毒性进行了深入研究。

精密肝切片技术是介于器官与细胞水平之间的体外实验手段，其保存了一定的组织结构，保留了所有类型的细胞、细胞间联系及各种肝药酶的活性。相对于细胞水平，更具宏观性与整体性，能较好地模拟体内的肝环境，可反映药物在体内的实际代谢过程，具有简单、快速、高通量等优点[32]。ALT和AST是目前最常用的反映肝功能损害最敏感的指标，ALT主要存在于肝细胞浆内，而AST主要存在于肝细胞线粒体中。当细胞膜通透性增大时， ALT漏出率增加；而当肝细胞严重病变坏死时，线粒体内AST便释放出来。GGT在肝内由肝细胞线粒体产生，其主要分布在肝细胞膜及毛细胆管上皮， LDH是体内能量代谢过程中的一个重要的酶；当肝细胞损伤或坏死时，细胞膜受到损伤，GGT和 LDH的漏出率就会升高[3334]。临床上观察何首乌导致肝功能损害的患者其肝生化指标特点为ALT 和AST 均显著升高，同时也伴有GGT及LDH的升高[3537]。此外，动物体内实验结果亦表明大鼠灌胃不同剂量的何首乌后，其血清ALT 和AST均有不同程度的升高；剂量越大、给药时间越长其升高程度越明显[8，3839]。精密肝切片实验结果显示，不同浓度的大黄酸与肝切片共培养 6 h 后，400 μmol·L-1组可使ALT，AST，LDH漏出率增加，100 μmol·L-1可使 LDH漏出率升高；且随药物浓度的增大蛋白含量显著下降，且显示一定的毒效关系。浓度为400 μmol·L-1的大黄素可引起ALT，GGT，LDH的漏出率增加。由此说明大剂量的大黄酸、大黄素在体外对肝组织均可表现出一定的毒性。大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷浓度为200 μmol·L-1时能引起肝切片LDH漏出率的显著升高；浓度增大至800 μmol·L-1时肝切片ALT，AST，LDH的漏出率显著升高；同时，随药物浓度的增大这3种酶的漏出率呈升高趋势且蛋白含量呈下降趋势。通过肝切片MTT实验还发现，肝切片与浓度为800 μmol·L-1的大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷共培养6 h后其MTT还原能力显著下降。

细胞毒性实验及精密肝切片实验均证明大黄酸、大黄素及大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷在大剂量时存在一定的肝毒性，该结果表明部分蒽醌对体外肝细胞及肝组织确实可产生一定的损害作用。但是，通过对何首乌中大黄酸、大黄素及大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷的含量进行总结得知：何首乌中大黄酸的质量分数范围为0～0023 2%；大黄素质量分数范围为0000 7%～0319%；大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷的质量分数范围为0014%～0064%[29，4046]。而且有文献报道志愿者按50 mg·kg-1（相当于大黄生药035 g·kg-1）单次口服大黄水提物，HPLC测定每克水提物中大黄酸质量分数为1230 8%，经检测后发现大黄酸在人体内的最大血药浓度为1428 μmol·L-1 [47]。由此可知65 kg的志愿者单次口服大黄酸的量为141 μmol，进而推算出人体的表观分布容积约为10 L。患者服用何首乌的剂量大部分为常规剂量[6，48]，药典规定生首乌的用量为3～6 g，制首乌的用量为6～12 g[2]，若按最大剂量12 g服用何首乌（大黄酸按最大质量分数0023 2%计算，大黄素按最大质量分数0319%计算，大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷按最大质量分数0064%计算），则大黄酸、大黄素和大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷暴露于体内的最大浓度应分别为098，1416，172 μmol·L-1，若要达到体外实验中产生肝毒性的浓度（大黄酸和大黄素为400 μmol·L-1，大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷为800 μmol·L-1），则需要分别单次服用4 898，339，5 581 g何首乌药材，而这显然是不合理和不可能实现的。因此，“蒽醌类成分是何首乌肝毒性成分”的说法是缺乏科学证据支持的。

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