何潆　何嘉娜　付俊　包玉婷　李昌煜　杨元宵

[摘要]该文探讨β细辛醚对Aβ142诱导星形胶质细胞活化所致PC12细胞损伤的保护作用及其机制，为β细辛醚在阿尔兹海默病（Alzheimers diease，AD）防治中的应用提供实验依据。首先，采用实时无标记动态细胞分析技术（Real time cell analysis，RTCA）构建RAh/PC12共培养体系，实时动态观察Aβ142诱导星形胶质细胞损伤后对共培养体系中PC12细胞存活率的影响，根据系统自动生成的存活率曲线和参数选出最佳的药物干预时间，采用不同浓度的β细辛醚对星形胶质细胞进行干预，观察共培养体系中PC12细胞存活率的改变；其次，采用MTT法检测Aβ142作用于RAh对PC12细胞存活率的影响以及β细辛醚的干预效应，验证RTCA的检测结果；进一步采用ELISA法检测下室培养液中IL1β，TNFα，BDNF的水平；Western blot法检测PC12细胞NFκB的活性和ERK，p38，JNK磷酸化水平。结果显示，β细辛醚（555 mg·L-1）能显著减缓Aβ142诱导的RAh活化引起的PC12细胞存活率下降（P<001），显著降低下室培养液中IL1β，TNFα的水平和PC12细胞ERK，p38，JNK磷酸化水平（P<001）；β细辛醚（1667 mg·L-1）能促进下室培养液中BDNF的释放（P<005）。以上结果表明，Aβ142诱导RAh活化并释放IL1β，TNFα等炎症因子加剧PC12细胞的损伤；β细辛醚能降低IL1β，TNFα和促进BDNF的释放，抑制PC12细胞NFκB的活性和ERK，p38，JNK磷酸化水平。

[关键词]β细辛醚；Aβ142；星形胶质细胞；PC12细胞；RTCA；NFκB

[Abstract]This study was aimed to investigate the protective effect and mechanism of βasarone on PC12 cells injury induced byAβ142 activated astrocytes， and provide experimental basis for βasarone application in the prevention and control of Alzheimer′s disease （AD） Firstly， RAh and PC12 cells were cocultured in the special transwell chamber， and the Real time cell analysis （RTCA） system was used to realtime observe its effect on PC12 cells survival rate in the coculture system after astrocytes injury induced by Aβ142. The best intervention time of βasarone was selected according to the survival curve and parameters generated automatically βasarone with different concentrations was used for intervention on astrocytes， then the changes of PC12 cells survival rate in the coculture system were observed Secondly， MTT assay was used to detect the effect of Aβ142 on PC12 cells survival rate as well as the intervention effect of βasarone， and verify the testing results of RTCA The levels of IL1β， TNFα and BDNF in culture media of the lower chamber were detected by ELISA The NFκB activity and phosphorylation levels of ERK， p38 and JNK were detected by Western blot Results showed that βasarone （555 mg·L-1） could significantly slowdown the decline of PC12 cells survival rate caused by Aβ142induced RAh activation （P<001）， significantly reduce the levels of IL1β， TNFα and the phosphorylation levels of ERK， p38 and JNK in culture media of the lower chamber （P<001） βasarone（1667 mg·L-1） could promote the release of BDNF in culture media of the lower chamber（P<005） These results indicated that Aβ142 could induce RAh activation and its release of IL1β， TNFα and other inflammatory factors to aggravate the PC12 cells injury； βasarone could reduce the levels of IL1β， TNFα， promote the release of BDNF， and inhibit the NFκB activity as well as phosphorylation levels of ERK， p38 and JNK protein in PC12 cells

[Key words]βasarone； Aβ142； astrocyte； PC12 cell； RTCA； NFκB

doi：10.4268/cjcmm20160720

近年来研究发现，星形胶质细胞作为中枢神经系统最丰富的细胞群，与阿尔兹海默病（Alzheimer′s diease，AD）的发生发展密切相关。AD早期可出现广泛、持续的星形胶质细胞激活[1]，其发展过程中脑内始终存在着以星形胶质细胞激活为特征的炎症反应。激活的星形胶质细胞产生并释放大量炎症因子和神经营养因子等，起初可进行自身保护，修复受损组织，保护神经元，持续的炎症反应则加剧Aβ的生成，加速神经元的损伤，诱发AD[2]。本实验通过构建星形胶质细胞和PC12细胞的共培养体系作为研究对象，能很好地模拟脑内微环境，较之于体外研究神经系统疾病的单一细胞模型具有一定的优势。

石菖蒲为天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott的干燥根茎，具有开窍豁痰、醒神益智的功效，临床上广泛应用于癫痫、健忘、耳鸣、中风失语、老年性痴呆等病症[3]。β细辛醚为石菖蒲的主要有效成分，其对β淀粉样蛋白诱导的PC12细胞凋亡具有抑制作用[45]，对AD模型大鼠海马神经元凋亡有一定的保护作用[67]。本课题组前期研究发现，β细辛醚对Aβ142诱导活化的星形胶质细胞损伤有保护作用。但β细辛醚的作用与Aβ活化的星形胶质细胞对PC12细胞的影响尚未见报道。本文在前期实验的基础上，研究β细辛醚对Aβ142诱导星形胶质细胞活化所致PC12细胞损伤的保护作用，为β细辛醚在AD防治中的应用提供实验依据。

1材料

荧光倒置显微镜（德国莱卡公司，型号DMI3000B）；CO2培养箱，生物安全柜（德国Thermo公司，型号分别为3111，1300Series A2）；酶标仪（美国BIOTEK仪器公司，Power Wave X340）；台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，Centrifuge 5430R）；电泳仪（美国BioRad公司，型号PowerPac Basic 1645050）；双色红外激光成像系统（美国LICOR公司，型号ODYSSEY）；实时无标记细胞功能分析仪DP系统（杭州艾森生物有限公司，CA92121）。

β细辛醚（纯度98%，金坛市威德龙化学有限公司，批号120MB711V）；Aβ142（上海吉尔生化有限公司，批号052487）；DMEM高糖培养基，胎牛血清，025%胰酶（美国Gibco公司，批号分别为8114420，1581730，1606137）；MTT（美国Amresco公司，批号2273C305）；大鼠IL1β ELISA试剂盒，大鼠TNFα ELISA试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司，批号分别为AB07AD0276，AB07AD0277）；大鼠BDNF ELISA 试剂盒（上海信帆生物科技有限公司，批号201505）；NFκB p56抗体（美国Abcam公司，批号GR2093561）；p38MAPK，pp38MAPK，ERK，pERK，JNK，pJNK抗体（Cell Signaling Technology公司，货号分别为8690s，4511s，4695s，4370s，9528，4668）；Lamin B1抗体（美国ImmunoWay公司，批号B3601）；GAPDH抗体（Santa Cruz公司，批号B0514）；羊抗鼠二抗，羊抗兔二抗（美国LICOR公司，批号分别为C205315，C4010904）；BCA蛋白定量试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号20130623）；细胞核蛋白与胞浆蛋白提取试剂盒（Beyotime公司，批号0301061503）；细胞全蛋白提取试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号Kap2100）；BSA（美国Life公司，批号A925BA0016）；PVDF膜（美国BioRad公司，批号1620177）。

RAh大鼠海马趾星形胶质细胞购自上海斯信生物科技有限公司；高分化PC12细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所。

2方法

21药物与试剂的配制

β细辛醚混悬液：称取一定量的β细辛醚粉末溶于100 μL DMSO中配制成母液（保证母液配制成所需最高药物浓度后DMSO的量在终体积01%以下），-20 ℃保存，备用。依据课题组前期实验结果，本文采用1667，555，185 mg·L-1作为实验剂量（给药前用PBS稀释成所需浓度）；Aβ142溶液：将Aβ142寡聚体溶于100 μL无菌PBS中，现配现用。给药前取一定量稀释至所需浓度即可。

22细胞培养

RAh：培养基为含10%胎牛血清和1%青链霉素溶液的DMEM高糖培养基，于5% CO2，37 ℃恒温细胞培养箱中培养，待细胞长至80%满度时，025%胰酶消化，1∶3进行传代。PC12细胞：培养基为含5%胎牛血清和1%青链霉素溶液的DMEM高糖培养基，其余同RAh。

23共培养体系的建立

向Eplate 16板中加入空培养基测定基线，取对数生长期的PC12细胞，分别以125×105，25×105，5×105，1×106个/mL的浓度接种于Eplate 16板，每孔100 μL（每个浓度4个复孔）。培养箱内放置30 min后检测，根据仪器自动生成的阻抗（CI）值和增殖曲线，确定PC12细胞的最佳接种密度；而后将不同浓度（0，25×104，5×104，1×105个/mL）RAh接种于Eplate Insert 16上室（各4孔，孔径04 μm），单独培养至贴壁后放入Eplate 16，与PC12共培养，根据2种细胞的最佳接种浓度，建立共培养体系。

24细胞模型的制备、分组及给药

241细胞模型的制备首先，取不同浓度Aβ142（33，10，30 μmol·L-1）作用于共培养体系的上室（RAh），观察共培养体系下室中PC12细胞的增殖曲线，并设置上室中不含星形胶质细胞的对照实验（含Insert），选取最强作用的Aβ142浓度，制备细胞模型。

242分组及给药将RAhPC12体系分为正常对照组、Aβ142模型组、β细辛醚185 mg·L-1+ Aβ142组、β细辛醚555 mg·L-1+ Aβ142组、β细辛醚1667 mg·L-1+ Aβ142组。

25PC12细胞存活率的检测

251RCTA法建立共培养体系后（步骤同23项），分别设置正常对照组、Aβ142模型组、β细辛醚185 mg·L-1+ Aβ142组、β细辛醚555 mg·L-1+ Aβ142组、β细辛醚1667 mg·L-1+ Aβ142组，给药组预先给予β细辛醚（185，555，1667 mg·L-1）1 h后给予Aβ142，放入仪器实时检测，观察48 h内各组的生长曲线，根据仪器自动生成的阻抗（CI）判断PC12细胞的存活率。

252MTT法采用96孔板替代RTCA法中的Eplate 16板，操作方法同RTCA法，药物作用完毕后取出Insert，换入新培养基100 μL，每孔加MTT 20 μL，继续培养4 h后，弃去上清，每孔加入150 μL DMSO，置于摇床上低速震荡10 min使结晶充分溶解。酶标仪检测490 nm处吸光度。

26ELISA法检测下室培养液中IL1β，TNFα，BDNF的水平

收集各组下室培养液，10 000 r·min-1离心10 min，取上清，20 ℃保存，备用。按试剂盒说明书分别检测各因子的水平。

27Western blot法检测PC12细胞NFκB的蛋白表达和ERK，P38，JNK的磷酸化水平

采用6孔板和6孔板适配的24 mm Insert，方法步骤同24项。药物作用48 h后，收集PC12细胞，分成2部分：一部分用于提取细胞核蛋白，一部分用于提取细胞全蛋白。样品经SDSPAGE凝胶电泳80 V分离2 h，350 mA 90 min湿转至PVDF膜。5% BSA封闭2 h，剪膜后分别加入一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后加入相应的荧光二抗孵育15 h，ODYSSEY双色红外激光成像系统曝光显色，蛋白含量用Image Studio Ver 20软件进行半定量分析。

28统计学分析

采用GraphPad Prism 602和SPSS 170对数据进行统计分析。结果以±s表示。每组数据先进行正态性检验，符合正态分布的多个样本均数比较采用单因素ANOVA分析，若方程齐采用LSD检验，若方程不齐则采用GamesHowell（A）检验，P<005为具有显著性差异，P<001为具有极显著性差异。

3结果

31细胞接种密度的确立

按对数生长期CI值达到1左右为标准选取最佳接种密度，即选取PC12细胞浓度为5×105个/mL；不同浓度（0，25×104，5×104，1×105个/mL）RAh对PC12的增殖无显著影响，见图1。本实验综合前期筛选的RAh的增殖曲线，选定RAh的接种密度为5×104个/mL。

32不同浓度Aβ142作用于RAh对PC12细胞存活率的影响

RTCA结果显示，RAh和PC12共培养24 h，10，30 μmol·L-1 Aβ142能显著降低PC12细胞的

存活率（P<001），33 μmol·L-1 Aβ142对PC12细胞的存活率无显著影响；共培养48 h，33，10，30 μmol·L-1Aβ142均显著降低PC12细胞的存活率（P<001），见图2。

A上室含RAh；B上室不含RAh；aRTCA法；bMTT法。与正常组比较1）P<005，2）P<001；与Aβ142模型组比较3）P<005，4）P<001（图3～5同）。

图2不同浓度Aβ142作用于星形胶质细胞对PC12细胞存活率的影响

Fig2Effect of different concentrations of Aβ142 activated astrocytes on viability of PC12 cell

MTT结果显示，共培养24 h，33，10 μmol·L-1 Aβ142对PC12细胞的存活率无显著影响，30 μmol·L-1 Aβ142能降低PC12的存活率（P<005），共培养48 h，10，30 μmol·L-1 Aβ142能显著抑制PC12细胞的存活率（P<001），Aβ142 3 μmol·L-1对PC12细胞的存活率无显著影响；同时，RTCA结果显示Aβ142（33，10，30 μmol·L-1）作用24，48 h均对PC12细胞的增殖无显著影响，与MTT的结果一致，见图2。综合以上结果，本实验选择10 μmol·L-1 Aβ142进行后续实验研究。

33β细辛醚对Aβ142诱导RAh细胞活化所致PC12细胞损伤的影响

RTCA结果显示，RAh和PC12共培养24 h，Aβ142模型组PC12细胞存活率比正常对照组显著降低（P<001）；β细辛醚（555 mg·L-1）组PC12细胞存活率相比于Aβ142模型组显著升高（P<001），β细辛醚（185，1667 mg·L-1）组PC12细胞存活率相比于Aβ142模型组无显著变化；共培养48 h，各组PC12细胞的存活率变化结果与24 h一致，见图3。

36β细辛醚对PC12细胞ERK，p38，JNK磷酸化水平的影响

Western blot结果显示，Aβ142模型组的ERK，p38，JNK磷酸化水平均显著高于正常对照组（P<001）；β细辛醚（185，555，1667 mg·L-1）组ERK的磷酸化水平相比于Aβ142模型组均显著降低（P<001）；p38的磷酸化水平相比于Aβ142模型组均无显著影响；与Aβ142模型组相比，β细辛醚（555，1667 mg·L-1）能显著降低JNK的磷酸化水平（P<001），β细辛醚（185 mg·L-1）对JNK的磷酸化水平无显著影响，见图5。

4讨论

石菖蒲是广泛应用于中枢神经系统疾病治疗的中药，具有神经元保护、改善学习记忆等作用。β细辛醚为石菖蒲的主要活性成分之一，在体内吸收分布快，且极易通过血脑屏障。本课题组前期研究发现，β细辛醚对东莨菪碱所致的学习记忆获得障碍、对亚硝酸钠所致的记忆巩固障碍及乙醇所致的记忆再现障碍模型小鼠均有改善记忆的作用，对Aβ2535所致的PC12细胞损伤有抗凋亡作用，对Aβ142诱导星形胶质细胞活化所致的损伤有保护作用，显示出良好的研究前景。

星形胶质细胞作为中枢神经系统内分布最广的细胞，与神经元之间存在复杂的相互作用，其激活介导的神经系统炎症反应在神经退行性疾病的发病和发展过程中起着重要的作用8]。研究发现[9]AD患者脑中存在大量激活的星形胶质细胞，围绕在神经炎性斑块周围。Aβ可以引起星形胶质细胞的活化，活化的星形胶质细胞中含有Aβ片段，为其在Aβ的降解中发挥作用。这些结果均表明星形胶质细胞在AD中发挥重要作用。适度激活的星形胶质细胞可胞吞Aβ蛋白，释放神经营养因子，保护神经元；但过度激活的星形胶质细胞，通过释放神经毒性的细胞因子和其他毒性物质，诱导神经元凋亡，加速AD病理进程。

本实验通过构建星形胶质细胞和PC12细胞的共培养体系，更好地模拟脑内微环境和2种细胞相互作用的关系。将β细辛醚作用于Aβ142活化的RAh细胞，观察与其共培养的PC12细胞存活率的变化。结果发现，10 μmol·L-1 Aβ142作用24，48 h均能使PC12细胞的存活率显著下降，β细辛醚（555 mg·L-1）能显著提高PC12细胞的存活率。β细辛醚能有效地抑制Aβ142诱导RAh活化导致的PC12细胞存活率下降，保护PC12细胞。

实验从抑制炎症角度，研究β细辛醚发挥保护作用的初步机制。Aβ寡聚体作用于星形胶质细胞，可使星形胶质细胞释放大量炎症因子，如IL1β，IL6，TNFα，IL8，活性氧等，作为初始的典型炎症反应，这些物质对神经元有毒性作用，促使神经元凋亡[1011]。前期实验研究发现β细辛醚能抑制Aβ142活化的星形胶质细胞IL1β，TNFα的表达。本实验采用不同浓度的β细辛醚处理Aβ142活化的星形胶质细胞，结果发现β细辛醚（555 mg·L-1）能有效降低共培养下室中IL1β，TNFα水平。Kimura等研究发现，在AD早期可发现星形胶质细胞对Aβ的反应性增强，Aβ可诱导星形胶质细胞产生脑源性神经营养因子（BDNF），促进神经元损伤后的存活和修复[1214]，减轻Aβ所致神经毒性。本实验研究发现，β细辛醚（1667 mg·L-1）能促进BDNF的释放。介导炎症最主要的通路为NFκB通路，AD的发生机制与其转录因子的活性调节密切相关，持续的炎症和氧化应激等引起的NFκB过度激活会加剧炎症反应和氧化应激，促进神经元的凋亡；另一条介导炎症的主要信号通路是MAPK通路，包括细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signalregulated kinase， ERK），cJun 氨基末端激酶（cjun NH2terminal kinase， JNK）和p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase，p38），一旦MAPK被磷酸化而激活，它可以进一步磷酸化并激活其他激酶或转录因子，如NFκB和AP1等[15]。本课题组前期实验结果表明，β细辛醚能抑制星形胶质细胞p38，ERK的磷酸化水平等。本实验研究发现，β细辛醚（555 mg·L-1）能有效抑制下室PC12细胞的NFκB活性和ERK，JNK的磷酸化水平。

综上所述，β细辛醚可能通过促进BDNF的释放，降低IL1β，TNFα的水平和ERK，JNK的磷酸化水平，以及抑制PC12细胞NFκB活性而起到保护作用。

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[责任编辑马超一]