刘晓琼　沈宏辉　陈佳欣　柏兆方　王伽伯　肖小河

[摘要]该文主要研究4种苦参碱类生物碱分别联合胸腺肽在HepG2215细胞上的抗病毒效果。分别将氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱、槐定碱（浓度均为02 mmol·L-1）联合胸腺肽（0025，01 g·L-1）于HepG2215细胞作用48，72 h后收集细胞及上清。采用CCK8法测定各实验组细胞的（活性）来评价药物对HepG2215细胞的毒性作用；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定实验组上清液中HBsAg，HBeAg的含量；采用荧光定量PCR法分别检测细胞上清和胞内HBV DNA水平；采用CBA方法检测上清液中细胞因子IFNα的表达量。结果显示，单独胸腺肽0025～04 g· L-1对细胞没有毒性，在此浓度范围内联合02 mmol·L-1苦参碱类生物碱对细胞没有毒性；苦参碱类生物碱联合胸腺肽抗HBV效果优于单独用碱或胸腺肽；单独0025 g· L-1胸腺肽组对胞内HBV DNA的抑制效果优于单独01 g· L-1胸腺肽组，而对于上清HBeAg的抑制效果则相反；01 g· L-1胸腺肽联合碱和0025 g· L-1胸腺肽联合碱抗HBV效果相当，4个生物碱和胸腺肽联合抗HBV效果无统计学差异；总体来看，72 h抗HBV效果优于48 h（P<005）；联合用药之后IFNα的分泌量升高，和其他4个指标的变化成正相关（P<005）。结果表明，氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱、槐定碱联合胸腺肽可通过促进IFNα的表达来抑制HepG2215细胞HBsAg，HBeAg的分泌和HBV DNA的复制，进而促进抗病毒作用。

[关键词]胸腺肽；苦参碱类生物碱；HepG2215细胞株；乙肝病毒

[Abstract]To investigate the antiviral effect of thymopolypeptides combined with 4 kinds of matrine type alkaloids on HepG2215 cells， oxymatrine， sophocarpidine， sophocarpine， and sophoridine （at concentration of 02 mmol·L-1 respectively） were respectively combined with thymopolypeptides （0025， 01 g·L-1）， and after 48 h and 72 h treatment on HepG2215 cells， the cells and supernatants were collected The cells activity in various groups was determined by CCK8 method to evaluate the toxic effects of the drugs on HepG2215 cells Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was used to determine HBeAg and HBsAg levels in cellular supernatants HBV DNA levels in cellular supernatants andcells were quantified with fluorogenic quantitative PCR method； and the expression level of IFNα in supernatants was detected with CBA method The results indicated that single thymopolypeptides at 002504 g·L-1 had no toxicity to cells Thymopolypeptides in this concentration range combined with 02 mmol·L-1 matrine type alkaloids also had no toxicity to cells AntiHBV activity of drug combination was better than that of alkali or thymopolypeptides alone Thymopolypeptides at 0025 g·L-1 had better inhibitory effect than thymopolypeptides at 01 g·L-1 on intracellular HBV DNA expression， but the inhibitory effect on supernatant HBeAg level was on the contrary AntiHBV activity was similar between alkaloids combined with 01 g·L-1and alkaloids combined with 0025 g·L-1 There was no statistical difference in antiHBV effect between various combined groups （P<005） In general， 72 h antiHBV effect was better than 48 h antiHBV effect （P<005） The expression of IFNα was increased after drug combination， with positive correlation to the changes of other four indicators （P<005） In conclusion， oxymatrine， sophocarpidine， sophocarpine and sophoridine combined with thymopolypeptides could inhibit HBsAg and HBeAg secretion in HepG2215 cells and HBV DNA replication， and further promote the antiviral effect by promoting the expression of IFNα

[Key words]thymopolypeptides； matrine type alkaloids； HepG2215 cells； hepatitis B virus

doi：10.4268/cjcmm20160719

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的传染性疾病，其发病机制与机体免疫功能低下和免疫调节紊乱有关[1]。目前乙肝的治疗主要是以核苷（酸）类似物、干扰素等抗病毒药物为主，但是长期用药容易导致病毒产生耐药机制，使HBV难以被彻底清除。胸腺肽作为一种免疫调节剂，对肿瘤和慢性乙肝有一定的疗效[2]；体外实验研究已证实胸腺肽α1（Tα1）能显著降低细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的浓度[3]，具有一定的体外抗病毒活性。但是胸腺肽效果不强，单独使用胸腺肽难以达到完全清除HBV的目的。苦参碱类生物碱是从山豆根、苦参、苦豆子类中草药中提取分离出来的单体化合物，主要包括氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱、槐定碱，结构式见图1。现代药理学研究发现，以氧化苦参碱为代表的苦参碱类生物碱具有保肝降酶、免疫调节以及抗乙肝病毒的作用，其免疫调节和抗病毒作用备受关注[45]。胸腺肽和苦参碱类生物碱的抗HBV机制不同于核苷类药物，前者调控患者的免疫，后者具有多种生物学效应，因此可以考虑从胸腺肽联合苦参碱类生物碱入手开展抗HBV尤其是耐药株的治疗，从而加强胸腺肽治疗慢性乙肝的疗效。由于目前尚未见到有关胸腺肽联合苦参碱类生物碱抗HBV的报道，本实验在细胞水平上对其联合应用后的抗HBV效果进行研究。

1材料

HepG2215细胞株由北京市解放军第302医院实验技术保障中心赠与。

氧化苦参碱，苦参碱，槐果碱，槐定碱（陕西昂盛生物医药科技有限公司，纯度>98%）；DMEM培养液，胎牛血清FBS，G418（美国GIBCO公司）；胰蛋白酶和二甲基亚砜（美国Sigma公司）；Cell Counting Kit8检测试剂盒（日本同仁化学研究所，批号JE914）；注射用胸腺肽（湖南科伦制药有限公司，批号13111272B）；HBsAg 和HBeAg检测试剂盒（北京科卫临床诊断试剂有限公司，批号分别为201410003，201501001）；乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司）；96 孔板，24孔板，细胞培养瓶（康宁公司）；Human IFNα Flex Set （美国BD公司，批号560379）。

酶标仪（BioTek Synergy H1 H1MFD，美国）；二氧化碳培养箱（NAPCO Model 5410，美国）；台式低速离心机（TD5A，湖南赫西仪器装备有限公司）；常规倒置显微镜（上海泽权仪器设备有限公司）；台式低速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）； FACS Calibur Flow Cytometry Syatem（BD 公司） 。

2方法

21细胞培养

HepG2215细胞常规培养于含10%肽牛血清的DMEM培养基（含青霉素100 U·mL-1，链霉素100 U·mL-1，G418 400 mg·L-1）中，置于37 ℃，5% CO2饱和湿度培养箱。

22CCK8法检测药物对细胞的毒性

取对数生长期的HepG2215细胞，以2×105个/mL接种100 μL于96孔板，24 h后加入不同浓度药物，氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱、槐定碱选择02 mmol·L-1，胸腺肽选择0025，005，01，02，04 g· L-1，设置单独生物碱组、单独胸腺肽组以及两者联合组，每个药物浓度设3个复孔，置于37 ℃，5% CO2饱和湿度培养箱培养72 h后，吸出上清，每孔加入含10% CCK8的培养基100 μL，37 ℃孵育1 h，用酶标仪测定450 nm的吸光度（A）。设置空白对照和细胞对照，实验至少重复3次。用以下公式计算不同浓度药物作用的细胞存活率：细胞存活率=（A实验孔-A空白孔） /（A对照孔-A空白孔）×100%。

23药物体外抗HBV效果

231HBV DNA的检测取对数生长期HepG2215细胞长满培养瓶后转种于24孔培养板上。细胞浓度稀释为2×105个/mL，每孔1 mL细胞，24 h后加入不同浓度的药物，氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱、槐定碱选择02 mmol·L-1，胸腺肽选择0025，01 g· L-1，浓度设置均根据预实验结果及参考文献，设置单独生物碱组、单独胸腺肽组以及两者联合组，每个药物浓度设3个复孔，设置不加药的对照孔，每天观察细胞生长情况。48，72 h收集上清培养液和细胞，收集的细胞上清用于HBsAg，HBeAg和HBV DNA的检测，用PBS洗3遍细胞，加入500 μL PBS，将培养板冻于-80 ℃冰箱，反复冻融3次，高速离心，取上清，检测HBV DNA。

232HBsAg和HBeAg的检测按231项操作收集的细胞上清液，用HBsAg及HBeAg诊断试剂盒检测HBsAg及HBeAg的表达，均用ELISA法检测。按照试剂盒的说明操作，于酶标仪450 nm波长处测定各孔吸光度（A），计算其抑制率，抑制率=（A对照孔-A实验孔）/A对照孔×100%。

233上清HBV DNA和胞内HBV DNA的检测按231项操作收集的细胞上清液，采用实时荧光定量PCR法检测HBV DNA，操作按试剂盒说明进行。用实验孔与对照孔的滴度计算其抑制率，抑制率=（对照孔滴度-实验孔滴度） /对照孔滴度×100%。

234CBA法检测IFNα的表达水平将待检样品从-20 ℃冰箱中取出，置于37 ℃复苏30 min，1 500 r·min-1离心5 min，吸取上层超悬物 50 μL 置于待检管，同时加入50 μL捕获微球，50 μL PE检测试剂，室温、避光孵育3 h。加入1 mL洗液，1 500 r·min-1离心5 min，弃上清，加入300 μL洗液上机。使用 BD Cell Quest 检测，将标准品和待检品捕获数据转入 BD CBA 软件，划出标准曲线和分析得出待检品的结果。

24相互作用分析

用金正均Q值法判断药物相互作用程度。Q=Ea+b/（Ea+Eb-Ea×Eb），Ea+b为合并用药的抑制率，Ea，Eb分别为A药和B药单独用药时的抑制率，式中分子代表实测合并效应，分母代表期望合并效应，Q即二者的比值。Q<085为拮抗（-），085≤Q<115为相加（+），Q≥115为协同（）。

25统计学分析

采用SPSS 200软件，应用配比t检验、相关分析和Oneway ANOVA进行统计分析。如果P<005，数据有统计学差异；反之，则没有统计学差异。

3结果

31药物对HepG2215细胞的细胞毒性

采用CCK8法研究药物对HepG2215细胞的毒性作用，结果见图2，单独胸腺肽0025～04 g·L-1和其联合02 mmol·L-1苦参碱类生物碱对HepG2215细胞存活率都在90%以上，说明所选浓度对细胞正常生长无显著性影响。

32胸腺肽和苦参碱类生物碱单独给药及联合给药的抗HBV效果比较

321苦参碱类生物碱和胸腺肽联合应用的抗HBV效果优于单药氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱和槐定碱联合胸腺肽的抗HBV效果见图3，表1。当苦参碱类生物碱分别联合0025 g·L-1胸腺肽时，给药48 h后，氧化苦参碱联合胸腺肽组对上清HBsAg和HBeAg抑制率均高于单用生物碱或胸腺肽，4个生物碱分别联合胸腺肽对上清HBV DNA抑制率均高于单用生物碱或胸腺肽；72 h后4个生物碱联合用药的HBsAg，HBeAg，上清HBV DNA抑制率都显著高于相应的单用生物碱或胸腺肽。当苦参碱类生物碱联合01 g·L-1胸腺肽时，48 h后氧化苦参碱、苦参碱分别联合胸腺肽组的上清HBV DNA抑制率均高于相应的单用生物碱或胸腺肽组，4个生物碱分别联合胸腺肽的HBsAg，HBeAg，胞内HBV DNA抑制率都显著高于相应的单用生物碱或胸腺肽；72 h后4个生物碱联合用药的HBsAg，HBeAg，上清HBV DNA，胞内HBV DNA抑制率都显著高于相应的单用生物碱或胸腺肽。结果显示苦参碱类生物碱氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱和槐定碱联合胸腺肽的抗HBV效果显著优于单用生物碱或胸腺肽。

322苦参碱类生物碱联合不同浓度胸腺肽的抗HBV效果给药48 h后，单独01 g·L-1胸腺肽对胞内HBV DNA的抑制率高于单独0025 g·L-1胸腺肽；72 h时，单独0025 g·L-1胸腺肽对HBsAg抑制率、胞内HBV DNA抑制率高于单独01 g·L-1胸腺肽。

苦参碱类生物碱联合01 g·L-1胸腺肽对HBeAg抑制率高于其联合0025 g·L-1胸腺肽；但是苦参碱类生物碱联合0025 g·L-1胸腺肽对上清HBV DNA抑制率高于其联合01 g·L-1胸腺肽。

323不同苦参碱类生物碱联合胸腺肽的抗HBV效果比较当苦参碱类生物碱联合0025 g·L-1胸腺肽时，给药48 h后，苦参碱对上清HBV DNA抑制率和HBeAg抑制率高于氧化苦参碱；给药72 h时，氧化苦参碱对上清HBV DNA抑制率低于其他生物碱，苦参碱对HBeAg抑制率低于其他生物碱。

当苦参碱类生物碱联合01 g·L-1胸腺肽时，给药48 h后，槐定碱对HBsAg抑制率高于表抗；给药72 h后，氧化苦参碱对胞内HBV DNA抑制率、HBsAg抑制率、HBeAg抑制率低于苦参碱。

3242个时间点的比较当苦参碱类生物碱联合0025 g·L-1胸腺肽时，72 h的苦参碱和槐果碱对上清HBV DNA，HBsAg，HBeAg抑制率高于48 h；当苦参碱类生物碱联合01 g·L-1胸腺肽时，72 h后4个生物碱对上清HBV DNA抑制率和胞内HBV DNA抑制率高于48 h后。

33细胞上清中IFNα的表达

各组IFNα的表达量见表2，48 h 02 mmol·L-1生物碱联合0025 g·L-1胸腺肽组的IFNα分泌量高于单独胸腺肽组，有统计学差异（P<005），02 mmol·L-1生物碱联合0025 g·L-1胸腺肽组的IFNα分泌量高于联合01 g·L-1胸腺肽组，差异有统计学意义（P<005）；72 h所有的联合用药组的IFNα分泌量高于单独用药组，差异有统计学意义（P<005）；各时间点不同生物碱联合用药组之间无显著性差异。

IFNα与其他指标的相关性分析见表3，IFNα的表达变化和上清HBV DNA，胞内HBV DNA，上清HBsAg，上清HBeAg的变化呈正相关性。

4讨论

HepG2215细胞株是1986年Sureau等[6]用克隆的HBVDNA转染人肝癌细胞HepG2建立的细胞株，该细胞株携带有HBV基因组，能够模拟体内肝细胞复制、组装和分泌HBV的过程，持续稳定地高水平分泌 HBsAg，HBeAg和乙肝病毒Dane颗粒， 是一个研究HBV生命活动的良好细胞系。HepG2215细胞出现后，很快应用于HBV致病机制和抗HBV药物评价研究，得到国内外广泛认可，一直应用至今[79]。HBV感染机体后通过其基因组与人体肝细胞整合来持续产生HBV，HepG2215细胞与此类似，同时还具有HepG2的稳定生长特性所以易于体外培养。因此，虽然HepG2215的来源细胞HepG2是肿瘤细胞，但是并不影响其HBV相关研究。

胸腺肽是从健康动物组织中提取出来的天然多肽，具有增强和调节人体免疫功能的作用。用于治疗各种原发性或继发性T细胞缺陷病，某些自身免疫性疾病，各种细胞免疫功能低下的疾病及肿瘤的辅助治疗[10]。由于胸腺肽能够促进 T 细胞免疫功能的恢复[11]，而且胸腺肽增加乙肝患者抗病毒蛋白的合成，所以胸腺肽用于免疫治疗在临床上受到重视。据报道，很多中药比如山豆根、艾叶、白术可以诱生干扰素[12]，而干扰素有直接抗病毒作用[13]。实验中发现苦参碱类生物碱可以诱导IFNα的A，B分别为48，72 h上清HBV DNA抑制率；C，D分别为48，72 h胞内HBV DNA抑制率；E，F分别为48，72 h HBsAg抑制率；G，H分别为48，72 h HBeAg抑制率。联合用药1组. 02 mmol·L-1苦参碱类生物碱联合0025 g·L-1胸腺肽；联合用药2组. 02 mmol·L-1苦参碱类生物碱联合01 g·L-1。与单独胸腺肽组比较1）P<005，与单独生物碱组比较2）P<005。

表达，联合胸腺肽之后，IFNα的表达量增加，IFNα的变化和其他指标呈正相关性，提示胸腺肽和苦参碱类生物碱单独或者联合用药可能是通过促进IFNα的表达来增强抗病毒效果的。

胸腺肽目前常用于慢性乙型肝炎的临床治疗，但是使用剂量不统一。通过实验表明，不同浓度的胸腺肽对HepG2215细胞的抗HBV效果不同。在抑制HBeAg方面，单独0025 g· L-1胸腺肽的效果优于单独01 g· L-1胸腺肽，但是对于胞内HBV DNA抑制率，单独01 g· L-1胸腺肽效果优于单独0025 g· L-1胸腺肽。胸腺肽不同浓度在细胞实验上的不同效果可知胸腺肽不同剂量对机体反应功能的调节也不同。这提示，在今后的临床合理应用中，针对不同疾病不同表征的用药剂量及规律，需要根据病人体质和病情的发展来研究和探讨。

临床研究表明采用胸腺肽联合干扰素或核苷（酸）类似物治疗慢性乙肝具有确切疗效[1416] ，体外实验证实氧化苦参碱和拉米夫定联合用药能够显著提高HBV的抑制水平[17]，氧化苦参碱可能会抑制耐药HBV的复制，从而和核苷类药物形成互补关系来协同抗病毒。但对于那些对核苷类似物容易产生耐药性以及对干扰素的治疗无效的慢性乙型肝炎患者来说，该疗法仍有一定的局限性。苦参碱类药品联合胸腺肽较少运用于实际临床治疗中，但是其对慢性乙型肝炎和肿瘤的预后治疗还是有一定疗效[1820]。本实验中，2个浓度的胸腺肽联合苦参碱类生物碱之后的抗HBV效果基本相当，且都优于单独胸腺肽的效果。这提示在临床用药中，对于不宜接受干扰素或核苷（酸）类似物治疗的病人，可以尝试用苦参碱类药品联合胸腺肽进行抗病毒治疗。

综上所述，苦参碱类生物碱联合胸腺肽抗HBV效果优于单独用药，其抗病毒机制可能与诱导IFNα的表达有关。二者的联合使用具有较高的临床研究价值和应用前景。此外，苦参碱类生物碱无论是单独还是联合用药，其抗病毒机制还有待进一步研究。

[参考文献]

[1]Yang P L， Althage A， Chung J， et al. Immune effectors required for hepatitis B virus clearance[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2010， 107（2）： 798.

[2]Larsson L I， Holck S. Occurrence of thymosin β4 in human breast cancer cells and in other cell types of the tumor microenvironment[J]. Hum Pathol， 2007， 38（1）： 114.

[3]刘晓梅. 胸腺肽α1（Tα1）体外抗HBV作用的实验研究[J]. 中国社区医师：医学专业，2010（9）：10.

[4]Xu W S， Zhao K K， Miao X H， et al. Effect of oxymatrine on the replication cycle of hepatitis B virus in vitro[J]. World J Gastroentero， 2010， 16（16）： 2028.

[5]Lu L G， Zeng M D， Mao Y M， et al. Oxymatrine therapy for chronic hepatitis B： a randomized doubleblind and placebocontrolled multicenter trial[J]. World J Gastroentero， 2003， 9（11）： 2480.

[6]Wu H L， Chen P J， Tu S J， et al. Characterization and genetic analysis of alternatively spliced transcripts of hepatitis B virus in infected human liver tissues and transfected HepG2 cells[J]. J Virol， 1991， 65（4）：1680.

[7]Li W， Jiang Y， Wang X， et al. Natural killer p46 controls hepatitis B virus replication and modulates liver inflammation[J]. PLoS ONE， 2015， 10（8）： e0135874.

[8]Mu D， Yan L， Tang H， et al. A sensitive and accurate quantification method for the detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA by the application of a droplet digital polymerase chain reaction amplification system[J]. Biotechnol Lett， 2015， 37（10）： 2063.

[9]Kongkavitoon P， Tangkijvanich P， Hirankarn N， et al. Hepatitis B virus HBx activates notch signaling via deltalike 4/Notch1 in hepatocellular carcinoma[J]. PLoS ONE， 2015， 11（1）： e0146696.

[10]Spangelo B L， Farrimond D D， Thapa M， et al. Thymosin fraction 5 inhibits the proliferation of the rat neuroendocrine MMQ pituitary adenoma and C6 glioma cell lines in vitro[J]. Endocrinology， 1998， 139（4）： 2155.

[11]Yunhua D， Yingling C， Xingping C， et al. A comparative study on the effect of BCGPSN and thymopeptides on Tlymphocyte subsets of normal and immunosuppressed mice[J]. J Huazhong Univ Sci Med， 2003， 23（4）： 339.

[12]徐艳， 马萍， 冯本华， 等. 中药诱生干扰素的研究近况[J]. 现代中西医结合杂志， 2005， 14（5）： 689.

[13]Tian Y， Chen W L， Ou J H. Effects of interferonalpha/beta on HBV replication determined by viral load[J]. PLoS Pathog， 2011， 7（7）： e1002159.

[14]木雪兰. 注射用胸腺五肽联合替比夫定治疗慢性乙肝26例疗效分析[J]. 中国实用医药，2015（18）：58.

[15]田洲，渠亚超，鲍旭丽，等. 胸腺五肽显著增强干扰素在抗病毒治程中的特异性CTL效应[J]. 现代生物医学进展，2015（7）：1259.

[16]王乡，陈积，舒乔. 恩替卡韦联合胸腺肽治疗52例高病毒载量慢性乙型肝炎疗效观察[J]. 广东医学院学报，2015（1）：98.

[17]Ma Z J， Li Q， Wang J B， et al. Combining oxymatrine or matrine with lamivudine increased its antireplication effect against the hepatitis B virus in vitro[J]. Evid Based Compl Alt， 2013， doi：10.1155/2013/186573.

[18]秦显灿. 胸腺肽α1联合苦参碱素治疗慢性乙肝30例观察[J]. 中国社区医师：医学专业，2011（30）：70.

[19]肖元元，赵瑜，赵华新，等. 复方苦参碱注射液联合胸腺肽疗法对肿瘤患者血清中肿瘤标志物的影响[J]. 现代肿瘤医学，2015（1）：119.

[20]朱冰，荣义辉，刘鸿凌，等. 苦参碱素联合胸腺五肽抗乙型肝炎病毒疗效观察[J]. 人民军医，2009（12）：807.

[责任编辑马超一]