方伟　杨印军　郭宝林　岑山

[摘要]该研究主要探究藏柴胡中的三萜皂苷类成分。采用大孔吸附树脂，MCI，硅胶，ODS，MDS柱色谱以及半制备高效液相色谱等分离纯化方法，从藏柴胡70%乙醇（含05% 氨水）提取物中得到12个化合物。利用高分辨质谱、核磁共振等波谱手段鉴定其结构分别为柴胡皂苷 b2 （1），柴胡皂苷 a （2），柴胡皂苷 b1 （3），柴胡皂苷 d（4），hydroxysaikosaponin a（5），柴胡皂苷 b3（6），柴胡皂苷 c （7），柴胡皂苷 i （8），柴胡皂苷 f （9）， chikusaikosides Ⅱ（10），柴胡皂苷 s（11），柴胡皂苷 I（12）。12个化合物均属齐墩果烷型三萜皂苷类化合物，其中化合物1，3，5，8～9，11～12均为首次从该植物中分离得到。体外抗流感病毒实验表明在20 μmol·L-1下，化合物2，4，6，8，11～12对流感病毒WSN33具有较明显抑制作用，其抑制率分别为913%，886%，534%，613%，773%，574% 。

[关键词]窄竹叶柴胡；三萜皂苷；齐墩果烷型

[Abstract]Twelve compounds were obtained by phytochemical investigation of 70% EtOH （ containing 05%NH3·H2O ）extract of the roots of Bupleurum marginatum var stenophyllum Based on comparison of their spectral data， including HRESIMS，1HNMR，13CNMR data，with those of the literature， their structures were elucidated as saikosaponin b2 （1）， saikosaponin a（2）， saikosaponin b1（3）， saikosaponin d （4）， hydroxysaikosaponin a （5）， saikosaponin b3 （6）， saikosaponin c（7），saikosaponin i （8）， saikosaponin f （9）， chikusaikosides Ⅱ（10）， saikosaponin s （11）， and saikosaponin I（12） All compounds belong to oleantype triterpenoid saponin and compounds 1， 3， 5， 89，11， and 12 were isolated from this plant for the first time At a concentration of 20 μmol·L-1， compounds 2， 4， 6， 8， 11 and 12 showed strong inhibition activity against influenza virus WSN33 with the inhibition rate of 913%，886%，534%，613%，773% and 574%，respectively

[Key words]Bupleurum marginatum var stenophyllum； triterpenoid saponin； oleantype

doi：10.4268/cjcmm20160716

近几年甘肃渭源等地的药材种植户引种了一种高产柴胡，流通名称叫“藏柴胡”，经鉴定来源于伞形科植物窄竹叶柴胡Bupleurum marginatum Wall. ex DC. var. stenophyllum （Wolff）Shan et Y. Li的干燥根，该植物为竹叶柴胡B. marginatum的变种[1]，分布于我国西部和西南部的2 700 m以上的高海拔地区，在我国贵州省药材标准中以“竹叶柴胡”的名称收载[2]，当地实际作柴胡使用。因为种植产量大和柴胡皂苷含量高，已经在甘肃、山西、陕西等地种植，在我国华北和西北地区有广泛的适应性，大有迅猛蔓延之势，对我国未来柴胡药材的资源格局将产生巨大的影响，非常有必要对该物种的栽培品进行系统的研究，以及和正品柴胡之间的比较，并进一步确认其有效性和毒性等。文献调研显示同柴胡属其他植物一样，本物种也主要含有皂苷类成分。本文报道了该物种系统化学分离工作的一部分，即分离得到的12个皂苷类成分，及其抗流感病毒活性。

1材料

Bruker AV 600 型核磁共振波谱仪，内标为 TMS；LTQObitrap XL 质谱仪（赛默飞世尔）；Agela CHEETAHTM中压制备液相色谱仪（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；Waters 高效液相色谱仪，包括 Waters 2535 型泵、Waters 2998 检测器、Empower Ⅲ色谱工作站（美国Waters公司）；柱色谱用硅胶（60～100，100～200，300～400目）及薄层色谱硅胶 GF254（青岛海洋化工厂）；ODSAQ（50μm）（日本YMC公司）；MCI GEL 和 MDS GEL（75 ～ 150μm）（日本三菱司）；D101 大孔树脂（沧州宝恩化工有限公司）；Unitary C18半制备色谱柱（中国华谱新创科技有限公司）；色谱级甲醇、乙腈（西陇化工股份有限公司），实验室所用其他试剂均为分析纯 ；二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司），DMEM，含EDTA的025% 胰酶，FBS（Invitrogen公司）。

藏柴胡于2014年7月购买自甘肃渭源，经中国医学科学院药用植物研究所郭宝林研究员鉴定为窄竹叶柴胡B. marginatum var. stenophyllum的干燥根，标本保存于本课题组。

2提取分离

82 kg藏柴胡干燥根粉碎后用10倍量加热至沸的70%乙醇（含05%氨水）浸泡提取2次，每次48 h。合并2次提取液，减压浓缩至无醇味，加水分散后上大孔树脂柱D101，分别用10%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，弃去10%乙醇洗脱部位，95%乙醇洗脱部位为总皂苷（400 g）。取总皂苷300 g拌样上MCI柱，分别用20%，40%，60%，90%，100%甲醇梯度洗脱。90%甲醇洗脱部位（150 g）拌样上硅胶色谱柱（200～300目）分离，用二氯甲烷甲醇梯度洗脱（25∶1～0∶1），经TLC检测后合并相同组分得到7个流分（A～G）。其中流分F经重结晶后得到化合物1（200 mg）。流分D经中压ODS分离（50%甲醇～100%甲醇）得到4个流分（D1～D4），其中流分D2经HPLC制备分离（80% 甲醇）得到化合物2（13 mg）。60%甲醇洗脱部位（120 g）再拌样上硅胶色谱柱（200～300目）分离，用二氯甲烷甲醇梯度洗脱（25∶1～0∶1），经TLC检测后合并相同组分得到3个流分（Ⅰ～Ⅲ）。经TLC和HPLC检测，将流分E和Ⅱ合并得到流分H1（516 g），流分G和流分Ⅲ合并得到H2（300 g）。H1经中压MDS分离（60%～90%甲醇）得到5个流分（H1O1～H1O5）。其中流分H1O4经HPLC制备分离（36% 乙腈），得到化合物3（7 mg）和化合物4（3 mg）。流分H1O2用HPLC制备分离（76% 甲醇）得到化合物5（6 mg）和化合物6（12 mg）。H2经中压MDS（40%～70%甲醇）分离得到6个流分（H2O1～H2O6），流分H2O4经HPLC制备分离（31% 乙腈）得到化合物7（50 mg）、化合物8（23 mg）和化合物9（12 mg）。流分H2O2经中压ODS分离得到6个组分，流分H2O25经HPLC制备分离（27% 乙腈）得到化合物10（7 mg）和化合物11（6 mg），流分H2O22经HPLC制备分离（22%乙腈）得到化合物12（5 mg）。

4化合物的抗病毒实验

将化合物分别溶解于DMSO中，配制成浓度为002 mol·L-1的储存液备用。将生长良好的293TGluc细胞以20×105个/mL浓度接种于96孔板中，每孔100 μL 。培养24 h后，每孔加入1 μL待测化合物，同时设置DMSO和Ribavirin分别为阴性和阳性对照组。1 h后利用WSN33感染细胞（MOI=05），继续培养24 h后，每孔取10 μL上清，于多功能酶标仪（Berthold Centro LB 960）测定Gluc活性。结果表明在20 μmol·L-1下，化合物2，4，6，8，11～12对流感病毒具有较明显抑制作用，其抑制率分别为913%， 886%， 534%， 613%， 773%， 574% 。

5讨论

柴胡属植物的主要成分为齐墩果烷型三萜皂苷类成分，其中结构里有13（28）环氧桥结构的一类是主要的活性成分，包括柴胡皂苷a， d等，该结构对酸和热不稳定。郭智等[9]研究显示不加碱的条件下，柴胡水提液pH值偏酸性，导致环氧桥结构被破坏，柴胡皂苷a， d含量大幅减少。所以，加碱是为了防止有环氧桥结构的皂苷在提取过程中被破坏。含碱溶液提取柴胡皂苷已经成为柴胡皂苷化学研究中普遍应用的方法，Li Z Y、唐智芳、杨瑶君、王鹏、戈宏焱等[1014]在其研究论文中都采取了加碱提取的方法。

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[11]唐智芳. 阿尔泰柴胡的化学成分及质量研究[D]. 北京：北京中医药大学，2010.

[12]杨瑶君. 阿尔泰柴胡的化学成分及质量研究[D]. 北京：北京中医药大学，2006.

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[14]戈宏焱 . 柴胡皂苷抗抑郁作用及其机制的研究[D]. 长春：吉林大学，2010.

[责任编辑丁广治]