吴雪莉　王毅　赵筱萍

[摘要]基于小分子荧光探针的中药活性成分筛选研究方兴未艾。该研究应用具有聚集诱导发光现象（AIE）的新型小分子荧光探针，对中成药消渴安中二肽基肽酶4（DPP4）抑制剂进行筛选。采用系统分离法，从消渴安中分离和制备了43个化学组分；以抑二肽素A为阳性对照药，对消渴安的43个组分进行筛选，发现13个化学组分对DPP4的活性具有抑制作用；采用LCMS技术对这13个组分进行定性分析，鉴定推断出16个化合物。进一步对其中14个化合物进行验证，发现5个化合物对DPP4具有较高的抑制作用，其中丹酚酸C、人参皂苷Rg5、知母皂苷AI在5～50 μmol·L-1呈良好的量效抑制关系。该研究为运用小分子荧光探针技术筛选发现中药药效物质提供了成功实例。

[关键词]DPP4抑制剂； 消渴安； 2型糖尿病； 聚集诱导发光现象； 荧光探针

[Abstract]Fluorescent bioprobes have attracted increasing attentions in studies for screening bioactive compounds from traditional Chinese medicines In this study， a newtype fluorescent probe with the function of aggregationinduced emission （AIE） was used to screen dipeptidyl peptidase4 （DPP4） inhibitor from Xiaokean formula， which has been clinically used for the treatment of type 2 diabetes mellitus Potential DPP4 inhibitors were screened by the fluorescent probe， with diprotin A as the positive control； totally 43 components were isolated from Xiaokean formula by systematic separation The results showed that 13 components can exert inhibitory effects on DPP4 activity； 16 compounds were further identified by liquid chromatographymass spectrometry （LCMS） from those active components The inhibitory effects of 14 compounds were further verified， while five of them showed significant inhibition against DPP4 Salvianolicacid C， ginsenoside Rg5 and timosaponin AI inhibited DPP4 activity at the concentration of 550 μmol·L-1 in a dosedependent manner Thus， our study provided a successful example for screening bioactive compounds from traditional Chinese medicines by using a novelfluorescent probe

[Key words]DPP4inhibitor； Xiaokean formula； type 2 diabetes mellitus； aggregationinduced emission； fluorescent probe

doi：10.4268/cjcmm20160714

二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase4，DPP4）是一种丝氨酸肽酶，可特异性识别具有促胰岛素分泌作用的肠促胰岛素N端第二位的丙氨酸，并切断N端2个氨基酸，使肠促胰岛素失活，胰岛素分泌减少[12]，血糖升高进而引发糖尿病。因此，DPP4抑制剂已成为目前治疗糖尿病的主要药物之一。消渴安由人参、知母、丹参、地黄、玉竹、枸杞子、地骨皮和黄连组成，是治疗2型糖尿病的临床经验方[36]，但该方的主要化学成分是否具有DPP4抑制作用有待研究。

本研究运用具有聚集诱导发光现象（aggregationinduced emission，AIE）的新型小分子荧光探针，考察消渴安主要化学组分对DPP4活性的抑制作用，并结合LCMS技术，对活性组分进行鉴定推断，旨在明确消渴安中具有DPP4抑制作用的主要化合物，为阐明该方抗糖尿病作用的药效物质基础提供依据。

1材料

11仪器TecanF200多功能酶标仪（Tecan，澳大利亚）；冷冻干燥机、FinniganLCQDecaXPplus离子阱质谱仪（ThermoFinnigan，美国）；Agilent Zorbax SBC18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）、Agilent 1200高效液相色谱仪，配有四元泵，二极管阵列检测器，自动进样器以及恒温系统（Agilent，美国）；岛津制备液相（岛津，日本）；MilliQSynthesis超纯水系统（Millipore，美国）；MiniSpin离心机（Eppendorf，德国）；XS105 DualRange分析天平（MettlerToledo，瑞士）。

12试剂二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase4，DPP4，来源于猪肾脏）、抑二肽素A（diprotinA）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、HEPES（Sigma，美国）；小分子荧光探针（上海淘普生物科技有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，Merck，德国）；甲酸（色谱纯，Tedia，美国）；乙醇（上海凌峰化学试剂有限公司）。

13药物消渴安胶囊购自通化华夏药业股份有限公司（批号1305021）；知母皂苷BⅡ、知母皂苷C、人参皂苷Rc、知母皂苷AⅢ、表小檗碱、黄连碱、丹酚酸C、人参皂苷Rg5购自上海融禾医药科技发展有限公司；新知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅠ购自上海源叶生物科技有限公司；人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、小檗碱购自中国药品生物制品检定所；人参皂苷Ro购自成都曼斯特生物科技有限公司。

2方法与结果

21消渴安胶囊化学组分的制备取消渴安胶囊内容物120 g，加入10倍量甲醇超声提取1 h。过滤，50 ℃下旋蒸至浸膏状，用100 mL超纯水复溶。复溶液用大孔树脂进行分离，依次用水、40%乙醇和95%乙醇洗脱，分别得到B01，B02，B03组分。B02和B03组分进一步用制备液相进行分离。制备液相色谱条件：流动相水（A）乙腈（B），流速10 mL·min-1，柱温30 ℃，B02组分梯度洗脱（0～40 min，5%～15% B；40～55 min，15%～20% B；55～60 min，20%～45% B；60～64 min，45%～100% B；64～70 min，100%B），B03组分梯度洗脱（0～60 min，30%～75% B；60～63 min，75%～85% B；63～65 min，85%～100% B；65～75 min，100%B），每个组分从第4 min开始接收样品，每3 min为1个组分，共21个组分，其中第21个组分为64～70 min的洗脱液。B02制得的各组分编号分别为D01～D21，B03制得的各组分编号分别为C01～C21。

22活性组分筛选由于组分B01和C16的制备量过少，无法满足筛选需要，所以本研究实际筛选了43个组分。取适量各待筛组分，用DMSO溶解，配成50 g·L-1储备液，临用前用HEPES缓冲液（05 mmol·L-1，pH 70）进行稀释。

本研究采用课题组建立的DPP4抑制剂筛选方法[7]，对消渴安组分进行筛选。实验分为空白组（含10 μmol·L-1小分子荧光探针）、对照组（含10 μmol·L-1小分子荧光探针和5 U·L-1 DPP4溶液）、样品对照组（含10 μmol·L-1小分子荧光探针和25 mg·L-1待筛组分）和样品组（含10 μmol·L-1小分子荧光探针、5 U·L-1 DPP4溶液和25 mg·L-1待筛组分），总反应体积为100 μL，HEPES缓冲液（05 mmol·L-1，pH 70）为反应溶剂，抑二肽素A作为阳性对照药。37 ℃孵育30 min后，酶标仪检测各组荧光强度（λex=320 nm，λem=450 nm），按下式计算各组分对DPP4的抑制率，其中I表示荧光强度。

DPP4抑制率=1-（I样品-I样品对照）/I样品对照（I对照-I空白）/I空白×100%

实验结果用±s表示。结果发现，在排除样品对荧光探针的干扰后有13个组分对DPP4的活性具有抑制作用，见图1。

23活性组分LCMS分析采用LCMS技术对活性组分进行鉴定分析。色谱条件为Agilent Zorbax SBC18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm），进样量5 μL，流速05 mL ·min-1，柱温35 ℃，流动相05%甲酸水（A）05%甲酸乙腈（B），梯度洗脱（0～20 min，5%～20% B；20～25 min，20%～26% B；25～50 min，26%～33% B；50～60 min，33%～40% B；60～70 min，40%～80% B；70～80 min，80%～100% B）。经过对13个组分的正负离子流图分析，发现B03负离子流图、C07正离子流图、C08正离子流图和C13正负离子流图基本包括了主要化合物信息，4个组分的离子流图见图2。

消渴安中对DPP4的活性具有抑制作用的13个化学组分，经过LCMS分析，主要鉴定或推断出16个化合物。其中化合物1，3～14通过与对照品的保留时间和质荷比（m/z）比对进行鉴定。化合物16在负离子模式下，可检测到[M-H] -和[M+HCOOH-H]-；在正离子模式下，可检测到准分子离子[M+H]+，因此推断化合物16为人参皂苷Rg5。同理，推断化合物2为新知母皂苷BⅡ，化合物15为丹酚酸C。具体信息见表1。

24化合物对DPP4活性的抑制作用将23分析出的16个化合物中的14个化合物按22项下方法考察对DPP4活性的抑制作用（知母皂苷Ⅰ和巴马汀由于没有对照品，所以没有进行验证）。结果发现丹酚酸C、人参皂苷Rg5、人参皂苷Ro、知母皂苷AI和知母皂苷AⅢ对DPP4有较强的抑制作用，抑制率分别为（9557±246）%，（9012±530）%，（5573±177）%，（5361±838）%，（4515±683）%，其中丹酚酸C、知母皂苷AⅠ和人参皂苷Rg5在5～50 μmol·L-1具有良好的量效抑制关系，见图3。

3讨论

肠促胰岛素是一类由肠道内分泌细胞分泌并对餐后胰岛素的分泌具有调节作用的肽类物质，主要包括胰高血糖素样肽1（glucagon like peptide1，GLP1）和葡萄糖依赖性促胰岛素肽（glucosedependent insulinotropic polypeptide，GIP）[2]。2型糖尿病患者的GIP促胰岛素分泌作用受损，虽然GLP1分泌不足，却依然具有促胰岛素分泌的作用[89]，因此，GLP1是治疗2型糖尿病的重要靶点之一。但由于GLP1在体内极易被DPP4水解，使得这类药物的临床应用受到很大限制。DPP4抑制剂可有效延长GLP1半衰期，降低糖化血红蛋白、调节血脂、加快胰岛β细胞增殖，并能提高肝脏和肌肉等组织对胰岛素的敏感性[10]。所以，DPP4抑制剂已成为糖尿病药物研发的热点。

目前，DPP4抑制剂常用筛选方法有荧光底物法[11]、发色底物法[12]和液质联用法[13]，其中荧光底物法具有灵敏度高、耗时短的优点，是目前应用最为广泛的DPP4抑制剂筛选方法[14]。但由于大多荧光探针具有浓度猝灭效应（concentration quenching effect，CQE）和聚集诱导荧光淬灭现象（aggregationcaused quenching，ACQ），限制了这些荧光探针的使用，而具有AIE现象的小分子荧光探针则可避免CQE和ACQ的产生[15]。在本研究中，运用具有AIE特性的新型小分子荧光探针进行DPP4抑制剂筛选，能够避免中药化合物所引起的紫外、荧光吸收；且由于该小分子荧光探针在反应体系中自身不发荧光，当DPP4切断荧光探针的N端二肽后，残基水溶性降低，发生聚集而产生荧光，因此该方法对DPP4的活性检测具有较高灵敏度和特异性。

本研究运用具有AIE现象的新型小分子荧光探针对消渴安中DPP4抑制剂进行筛选，发现丹酚酸C、人参皂苷Rg5和知母皂苷AI对DPP4具有抑制作用且在一定浓度范围内呈量效抑制关系。研究表明，人参总皂苷[16]和知母提取物[17]都能增加GLP1的分泌，可作为潜在GLP1激动剂。而在本研究中，发现人参皂苷Rg5和知母皂苷AI对DPP4具有抑制作用，推测消渴安既能抑制GLP1的水解，又能促进GLP1的分泌，可从2个方面发挥治疗糖尿病的作用。另外，人参皂苷Rg1和Rb1的抗糖尿病作用分别与Fas信号通路和Caspas3信号通路有关[18]；知母提取物通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine5′monophosphateactivated protein kinase，AMPK）改善葡萄糖和脂质代谢[19]；丹参可溶性多糖通过降低氧化应激水平改善胰岛素抵抗[20]。可见消渴安治疗糖尿病是通过多靶点、多环节、多途径而发挥作用的。但目前关于人参、知母和丹参中活性化合物抑制DPP4的研究还少见报道，所以对本研究筛选到的化合物，其抗糖尿病活性与作用机制还有待于进一步研究。

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[责任编辑孔晶晶]