张　珏，　沈　洁，　隋晓辰，　刘昱均（.卫生部核医学重点实验室/江苏省原子医学研究所，江苏无锡4063；.食品科学与技术国家重点实验/江南大学，化学与材料工程学院，江苏无锡4）



微波辅助合成硫酸化发酵灵芝胞外多糖的研究

张珏1，沈洁2，隋晓辰2，刘昱均2
（1.卫生部核医学重点实验室/江苏省原子医学研究所，江苏无锡214063；2.食品科学与技术国家重点实验/江南大学，化学与材料工程学院，江苏无锡214122）

摘要：多糖的硫酸化修饰能提高多糖的生物活性。从灵芝深层发酵液中获取灵芝胞外多糖，以二甲基甲酰胺为反应溶剂，采用氨基磺酸为酯化剂，探讨了微波辅助加热合成多糖的途径。结果表明，将尿素作为催化剂微波辅助合成硫酸酯化多糖，反应条件温和，取代度可高达2.67。因此微波辅助合成法为获取高取代度硫酸化灵芝多糖开辟了一条新途径。

关键词：灵芝；多糖；硫酸化；发酵

灵芝多糖为灵芝中最重要的活性成分之一，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等药理活性[1-3]。随着现代生物工程技术的发展，通过液态深层发酵可规模化定向获取灵芝多糖[4-5]。但发酵灵芝胞外多糖的抗肿瘤活性却并不理想[6]。为解决这一问题，通过多糖的硫酸化修饰来提高多糖的生物活性[7-9]。研究表明，灵芝胞外多糖经硫酸化修饰后其抗肝癌活性明显提高，且硫酸化取代度（DS）与其生物活性密切相关[10-13]。目前对灵芝多糖硫酸化修饰的研究多集中于子实体多糖[14-15]，关于发酵灵芝多糖硫酸化的报道相对较少[8]。在多糖硫酸化工艺上多采用氯磺酸酯化法[12，16-17]，并且以传统的常规加热方式来提供能量，这就带来了反应时间长、副反应多、取代度较小（DS=0.8-1.5）等弊端[10，12，18-19]。对于合成高取代度的硫酸酯化多糖的报道更为少见[20]，另外以氨基磺酸作为酯化试剂的报道也相对较少[21]。

微波辅助合成技术利用微波替代传统的加热方式，可降低反应活化能，提高反应速率，具有高转化率、高选择性、低能耗、清洁环保等特点[22]。作者采用微波辅助合成法对灵芝胞外多糖进行硫酸化修饰，考察各因素对取代度的影响，旨在得到一条高效、可控、取代度高、反应条件温和的多糖硫酸化合成途径。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

发酵灵芝胞外多糖：江南大学章克昌教授实验室提供；无水硫酸钠、N，N-二甲基甲酰胺、苯酚、吡啶、浓硫酸、乙醇、氯化钡、氢氧化钠、甲酰胺、氨基磺酸：AR，国药集团化学试剂有限公司产品；明胶：Amresco生物科技有限公司产品；氯磺酸：CP，上海金山亭化工试剂厂产品。

微波催化合成萃取仪：XH-100A，北京祥鹄科技发展有限公司产品；紫外分光光度计：T-6，普析通用仪器有限责任公司产品；透析袋：截留相对分子质量3 500，美国Viskase公司产品；冷冻干燥机：EZ585Q，美国FTS System公司产品；旋转蒸发仪：RE-52，上海本波仪器有限公司产品。

1.2方法

1.2.1硫酸酯化灵芝胞外多糖的制备流程将一定量的灵芝胞外多糖加入装有二甲基甲酰胺的烧瓶中，室温下搅拌30 min使多糖均匀分散在溶剂中。将烧瓶放入微波反应器中，选择恒温模式，一定温度下预热30 min后缓慢加入氨基磺酸，设置反应所需的微波功率。反应结束后迅速将烧瓶置于冰水浴中，反应液用4 mol/L NaOH调节pH至7后用体积分数90%乙醇沉淀，离心取沉淀。沉淀先用90%乙醇洗涤再用去离子水复溶，用流水透析24 h。透析袋内液体冷冻干燥后即得灵芝胞外硫酸化多糖。

1.2.2硫酸基含量测定：采用BaCl2-明胶浊度法采用BaCl2-明胶浊度法[23]，取代度（DS）计算公式：

DS=（1.62×S）/（32－1.02×S），其中S%为硫质量分数。

2　结果与讨论

2.1硫酸酯化试剂的筛选

硫酸基团的引入影响着多糖的生物活性，硫酸酯化试剂则对反应有一定的影响。作者分别考察了氯磺酸和氨基磺酸对取代度的影响。

从图1可看出，氯磺酸和氨基磺酸在各自最佳反应温度下的取代水平相似，但氨基磺酸对反应温度更为宽泛。相比用氯磺酸合成的硫酸酯化灵芝多糖，氨基磺酸法合成的硫酸酯化灵芝多糖色泽较浅，反应过程温和。

图1　不同硫酸酯化试剂对DS的影响Fig. 1 Effectof sulfuric acid esterification reagent on DS

2.2微波辅助合成对取代度的影响

氨基磺酸是一种温和的硫酸酯化试剂。在微波合成反应中，通过极性分子的偶极旋转和离子传导两种作用将能量直接传递到反应物上。同时，分子的整体运动能够活化分子，有利于其形成过渡态，从而降低反应体系的活化能，最终使反应速率加快，选择性提高。

微波辐射对多糖硫酸酯化的影响见图2。采用微波法合成硫酸酯化多糖具有反应时间短，转化率高等优点。但这也提高了对温度的选择性。温度过低（＜80℃）不利于反应充分进行，而温度过高（＞90℃）则导致氨基磺酸分解，同样降低了取代度。反应温度为90℃时，多糖硫酸化的取代度达到最大为1.37，并且产物颜色较浅，说明副产物较少。因此，作者选取90℃为最佳的合成温度。

图2　微波辐射温度对灵芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影响Fig. 2 Effect of reaction temperature on DS

2.3微波辐射功率对取代度的影响微波辐射功率通过影响体系的温度和反应初速度来影响反应的取代度。由图3可知，微波功率在100～300 W时，微波提供的能量较低，体系仅处于微波辐射加热状态，无法有多余的能量传递到反应分子上使其活化。当微波功率高于400 W时，体系能维持最适反应温度90℃，并有一定的能量传递到反应分子上，且在一定范围内取代度随功率增加而增大。当功率超过500 W时，硫酸酯化胞外多糖的取代度有所增加但并不显著。这可能是由于过大的功率导致反应温度上升，从而不利于取代度的提高。综上所述，500 W为最佳的微波辐射功率。

图3　微波辐射功率对灵芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影响Fig. 3 Effect of microwave radiation power on DS

2.4微波辐射时间对取代度的影响

微波辐射时间对灵芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影响见图4。在微波功率为500 W、辐射时间超过120 s时，灵芝胞外多糖硫酸酯化取代度明显提高。但随着反应时间的延长，取代度并未明显增大。考虑到微波辐射下各底物偶极矩的强烈变化可能对反应物和产物的稳定性带来不确定因素。并且反应时间过短不利于反应充分进行，反应时间过长则加剧氨基磺酸分解。故选取微波辐射反应时间为240 s。

图4　微波辐射时间对灵芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影响Fig. 4 Effect of microwave radiation time on DS

2.5反应物料摩尔比及催化剂在微波辅助合成中对取代度的影响

在微波辅助合成反应物中，反应物的分子极性越大，偶极旋转越强，产生的热量也越大，从而提高了微波的效能作用，由此增大了反应体系中反应物分子的碰撞频率或有效碰撞的几率。因此，有必要探讨微波合成中多糖与氨基磺酸的摩尔比。此外，催化剂的存在也是影响酯化反应速率的重要因素。微波辐射在加速多糖的氨基磺酸酯化速率的同时也不可避免地导致氨基磺酸的分解。而尿素的加入能有效缓解这一问题。在微波辐射反应中将尿素作为催化剂不仅加快了反应速率，提高硫酸酯化多糖的取代度，还提高了氨基磺酸的利用率。

从图5结果可看到，在没有催化剂的情况下，多糖与氨基磺酸摩尔比的增大使得取代度略有增加。当物料摩尔比为1∶3时，对应的取代度为1.5。将尿素作为催化剂，物料摩尔比超过1∶2时，取代度明显增大。这表明在微波场中，尿素的催化性能得到显著提高，有效提高了底物转化率。并且在反应时间仅为4 min时获得的硫酸化灵芝胞外多糖的取代度高达2.63，高于目前已有文献所报道的取代度。

图5　尿素在微波辅助合成硫酸酯化灵芝胞外多糖取代度的影响Fig. 5 Effect of urea under microwave radiation on DS

3　结语

以氨基磺酸为硫酸化试剂，对微波辅助合成硫酸化发酵灵芝胞外多糖的工艺条件进行了探讨。由此获得最佳工艺条件为：微波辅助反应温度为90℃，反应时间为4 min，微波功率为500 W，物料比（多糖的单糖残基与氨基磺酸摩尔比）为1∶3，催化剂尿素的用量为氨基磺酸质量的25%。在该条件下获得的硫酸化发酵灵芝胞外多糖的取代度高达2.67。并且该反应快速温和、易控制。由此可见，微波辅助法合成硫酸化多糖是一种易于规模化、能获取高取代度的合成方法。

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Microwave Assisted Synthesis of Sulfated Extracellular Polysaccharide from Submerged Fermentation of Ganoderma Lucidum

ZHANG Jue1，SHEN Jie2，SUI Xiaochen2，LIU Yujun2
(1. Key Laboratory of Nuclear Medicine of Ministry of Health / Jiangsu Institute of Nuclear Medicine，Wuxi 214063，China；2 State Key Laboratory of Food Science and Technology / School of College of Chemical & Material Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：Sulfation of polysaccharides can improve their biological activities. To efficiently prepare the sulfated extracellular polysaccharide from submerged fermentation of Ganoderma Lucidum，microwave assisted synthesis was established in this paper，using dimethylformamide as solvent and aminosulfonic acid as esterifying reagent. Results showed that the microwave assisted synthesis with urea as catalyst led to a high substitution degree of 2.67，and the reaction was mild. Thus，microwave assisted synthesis is a new approach to obtain sulfated polysaccharides with high degree of substitution.

keywords：Ganoderma Lucidum，polysaccharide，sulfation，submerged fermentation

作者简介：张珏（1969—），女，上海人，工学博士，副研究员，主要从事天然产物提取研究。E-mail：zhangjue@jsinn.org

基金项目：中央高校自主科研项目（JUSRP11517）；食品科学与技术国家重点实验室自由探索基金项目（SKLF-ZZB-201504）；无锡市科技支撑计划—社会发展项目（CSE01N1239）。

收稿日期：2014-08-08

中图分类号：O 657.3

文献标志码：A

文章编号：1673—1689（2016）01—0107—05