杜前进 邓成儒 赵怀宝 陈川平 曾俊辉

摘 要 使用三亚市美藤果种植基地种植的美藤果种仁的脱脂粉，分别采用酶法除杂浓缩法和碱溶酸沉淀法进一步提取蛋白质，分别得到美藤果浓缩法蛋白（PPC）和碱提取的蛋白（PPI）。实验数据表明：其等电点近似为pH 4.5；2种方法提取蛋白粉的溶解性都是随pH的升高呈先降低后升高的趋势；在吸水性、吸油性和起泡性方面，PPC比PPI略好；在溶解性和粘度方面，PPI优于PPC；在50℃左右PPC和PPI吸油性最大时，分别达到293%和165%。

关键词 美藤果 ；种仁 ；酶法除杂浓缩法 ；碱溶酸沉淀法 ；蛋白质功能 ；蛋白质性质

中图分类号 TS225.1 文献标志码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.05.021

Abstract Through enzymatic removal of impurity concentration method and alkali soluble acid precipitation method to extract proteins in Plukenetia volubilis linneo seed from defatted powder， getting protein concentrate （PPC） and protein isolate （PPI）. Results showed that their isoelectric point is pH 4.5. When the value of pH is increasing， the solubleness of protein is decreasing and then increasing. PPI has better solubility and viscosity than PPC. PPC has better water imbibition， oil absorption and foaming ability than PPI. The oil absorption capacities of PPI and PPC reach the highest when temperature was around 50℃， the value are 293% and 165%， respectively.

Keywords Plukenetia Volubilis Linneo ； seed ； enzymatic removal of impurity concentration method ； alkali soluble acid precipitation method ； protein function ； protein property

美藤果（Plukentia volubilis Linneo）为被子植物门双子叶植物纲大戟目大戟科的木质藤本多年生油料作物，又名印加花生、山花生、南美油藤、长寿果、印奇果、星油藤、印加果等，原产南美洲安第斯山脉的亚马逊河流域巴西的雨林地区，当地土著居民食用了几千年[1-2]。课题组在海南三亚引种种植美藤果，1 年就可以结果。美藤果种仁中不仅含有丰富的不饱和油脂、人体必需蛋白质和优质氨基酸，而且还含有多种维生素和酚。油脂、蛋白质、氨基酸、维生素、醇等物质是组成美藤果种仁的主要部分，也是研究开发利用的主要方向[2-7]。在其种仁榨完油之后，还剩余大量的美藤果饼粕未被利用，这不符合绿色环保的理念和可持续发展的战略[3]。对废弃的美藤果饼粕来说，不仅是一种资源的浪费，而且还造成环境污染。目前，对美藤果所含蛋白质的研究不多[2，7-11]，工业上提取蛋白质的方法主要有酶法除杂浓缩法[8]和碱溶酸沉淀法[9-12]。本实验采用这2种生产工艺美藤果的蛋白质性质进行比较和分析[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

美藤果种仁，采摘于海南启星生物科技有限公司美藤果种植示范基地，去壳机械榨油后的美藤果饼粕，保存于零下25℃冰箱中备用。

仪器：pH试纸、培养皿、离心管、玻璃棒、量筒、烧杯、锥形瓶、铁架台、天平、高速离心机 、紫外可见分光光度计、高速万能粉碎机、碳氮分析仪、快速干燥机、恒温水浴锅、匀浆机、烘箱、奥氏粘度计等。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

1.2.1.1 美藤果饼粕处理

将美藤果种仁饼粕于-25℃的冰箱中取出，自然风干2 h，捣碎包装好放入烘箱，95℃ 烘干5 h。取出于高速粉碎机中粉碎，过60目筛，所得粉末在45℃水浴锅下用石油醚浸泡脱脂 6 h，然后置于通风橱中风干24 h 以上，挥干石油醚所得美藤果种仁脱脂粉，再次放入80℃烘箱中烘干3 h，再用高速粉碎机粉碎，过100目筛，所得美藤果种仁蛋白质粉末，于阴凉干燥处保存备用。

1.2.1.2 2种美藤果蛋白粉的制备

酶法除杂法提取美藤果蛋白质粉末流程：取干燥的美藤果种仁脱脂粉→85%乙醇除去多余的糖→α-淀粉酶除去干扰实验的杂质（淀粉酶用量为1.5%，提取温度为水浴50℃）→95%乙醇洗涤→高速离心机离心（离心速率4 000 r/min，离心时间20 min）→烘干沉淀（烘干温度为50℃）→美藤果浓缩蛋白粉末（PPC）[5]。

碱溶酸沉法提取美藤果蛋白粉末流程：取干燥的美藤果种仁脱脂粉→用碱NaOH溶解[其中配置NaOH溶液pH为11.5，NaOH溶液与美藤果种仁脱脂粉液料体积质量比为25∶1（mL∶g），提取时间150 min，提取的水浴温度60℃]→离心机离心（离心速率4 000 r/min，离心时间20 min）→蛋白粉溶液等电点沉淀→静置分离沉淀→洗涤沉淀→风干干燥→继续烘干干燥→美藤果碱提蛋白粉末（PPI）[5]。

1.2.2 项目测定

1.2.2.1 美藤果种仁脱脂粉蛋白等电点测定

美藤果蛋白等电点的测定方法[13]：用天平称取5.0 g美藤果脱脂蛋白粉末，与蒸馏水按料液质量体积比为1∶20（g/mL）的比例于烧杯中混合搅拌均匀，用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl溶液调节溶液的pH至4.5，水浴加热到50℃，搅拌浸提1 h后，将溶液导入离心管，在室温下以4 000 r/min离心20 min。取等量上清液，用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl溶液分别调至一定pH梯度3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7，装入离心管离心。离心分离后，立即采用考马斯亮蓝法测定上述清液中的蛋白质含量。所测蛋白质所残留最低的上清液的pH即是美藤果种仁蛋白的等电点。重复2次，取3次的平均数。

1.2.2.2 2种不同蛋白粉末的吸水性测定

用分析天平准确称取0.5 g的美藤果脱脂粉蛋白粉末样品各11份，分别加入装有10 mL蒸馏水的离心管中，用1 mol/L的HCl或l mol/L 的NaOH溶液调节溶液的pH分别为2～12，并标号，混合均匀后震荡，室温下静置30 min，称量离心管的重量并记录数据。放入离心机以 3 500 r/min的速度离心20 min，再小心吸除离心管上层水层后，称量离心管的重量，并记录数据。

根据公式计算吸水性：吸水性（%） =（m2-m1）/m×100%。重复2次，取3次的平均数作为结果进行分析。

1.2.2.3 2种不同蛋白粉末的吸油性测定

用分析天平称取0.5 g蛋白粉末各5份样品，分别加入含有 10 mL 蒸馏水的离心管中并标号，混合均匀后进行震荡，并在水浴锅中以30、40、50、60、70℃水浴30 min之后，称量离心管的总重量，并记录数据。然后放入离心机以3 500 r/min的速度离心20 min后取出，小心吸出上层油层后，称量离心管的总重量。根据公式计算吸油性：吸油性（%）=（m2-m1）/m×100%。重复2次，取3次的平均数作为结果进行分析。

1.2.2.4 2种不同蛋白粉溶解性测定

测定美藤果蛋白溶解性的方法[21]：分别配制2种1%（m/V）美藤果脱脂粉末蛋白质溶液于锥形瓶中，用配置标准的1 mol/L NaOH或者l mol/L HCl 溶液来调节溶液的pH，梯度分别为2～12。用玻璃棒不断搅拌并震荡，20 min后再装入离心管，以4 000 r/min的速度离心，30 min后，立即取出于锥形瓶中收集上清液。用凯氏定氮法测上清液和样品中的蛋白质含量，计算样品中的氮溶解指数（NSI）。氮溶解指数（%）=上清液中的含氮（mg）/样品中的含氮量（mg）×100。

1.2.2.5 2种蛋白质粉末起泡性测定

准确称取1.25 g蛋白样品各3份，分别加入含50 mL蒸馏水的锥形瓶中，震荡混合均匀后全部倒入高速匀浆机中，l0 000 r/min搅打2 min后，立即全部倒入500 mL的量筒中，测量泡沫体积并记录数据。蛋白质的起泡性按以下公式计算：

起泡性（%）=泡沫停止时所量泡沫体积/美藤果蛋白溶液总体积×100%。

然后，立即将量筒置于30℃恒温水浴锅中，分别于10、20、30、40、50、60 min 时段记录残留泡沫体积，并计算相应起泡性。2组实验分别重复3次。

1.2.2.6 2种蛋白质粉末黏度测定

准确称取0.5 g的2种美藤果脱脂蛋白粉末各3份，分别倒入50 mL 含有1.0%（m/V）海藻酸钠蒸馏水的烧杯中，混合震荡均匀后，分别置于水浴锅中水浴加热，在30、40、50、60、70℃温度作用下1 h后，用奥氏黏度计测定其黏度，并记录数据，取3次的平均数作为结果进行分析。

1.2.3 数据分析

采用碳氮分析仪测定美藤果种仁脱脂粉末中的粗蛋白质含量。粗灰分含量测定参照LY/T 1268-1999、粗纤维含量测定参照GB/T 6434-2006、粗脂肪测定参照GB/T 14772-2008、水溶性糖测定参照YC/T159-2002标准进行测定[7]。

2 结果与分析

2.1 美藤果种仁蛋白脱脂粉的化学成分

从图1可以看出，粗蛋白质是美藤果脱脂粉中的主要化学成分，其蛋白质含量高达63.62%，在植物中已遥遥领先。水溶性糖含量占样品总量的9.58%，但对于提取蛋白质来说，水溶性糖是生产过程中需去除的杂质；粗纤维含量5.47%，粗灰分含量6.32%，含量相近，但也是蛋白质除杂工艺必须除去的杂质。粗脂肪的含量相对最少，只有2.06%。

2.2 美藤果种仁蛋白的等电点分析

由图2可知，当美藤果脱脂粉蛋白质溶液的pH值在3～4.5时，美藤果脱脂粉蛋白溶液的吸光值随着pH值的增大而降低，然后又随着美藤果脱脂粉蛋白质溶液pH值的逐渐升高而吸光值也不断升高，只是升高的趋势不强。当pH值在4.5左右时，美藤果脱脂粉蛋白质吸光度达到最小值，所以，上清液中残留的美藤果种仁蛋白质含量最小，析出的沉淀最多，故此时即为美藤果种仁蛋白的等电点。加酸至等电点是从提取液中分离蛋白的最简便方法。它能确保提取液中蛋白质最大量的沉淀。由图2可知，美藤果种仁脱脂粉蛋白的等电点pH值约为4.5。这与文冠果（pH在4.6）[14]和茶子树（pH为4.0）相近，跟赵旻等[3]的云南星油藤种仁蛋白结果一致。

2.3 2种方法得到的蛋白的吸水性比较

图3显示，美藤果脱脂粉碱提蛋白（PPI）和浓缩蛋白（PPC）在不同梯度pH下的吸水性。在等电点pH约为4.5时，吸水性最低。其美藤果脱脂粉蛋白质分子间作用力此时最强，而美藤果蛋白质分子与水分子的结合受到一定限制，就会导致吸水性降到最低。而对于美藤果脱脂粉浓缩蛋白（PPC）并没有经过碱溶解过程，也许还会受到少量粗纤或者维粗脂肪等美藤果组分等因素的影响，所以变化呈现不规律的现象。对于美藤果脱脂粉碱提蛋白（PPI）而言，以pH=4.5为中间点，pH增高或降低时，吸水性都升高。因为蛋白质分子所带有的净电荷量增多，结合能力也会随之增强，从而导致吸水性增大。本试验研究表明：浓缩蛋白（PPC）在同等条件下，吸水性大于碱提蛋白（PPI）。

2.4 2种方法得到的蛋白的吸油性比较

由图 4可以看出，美藤果脱脂粉PPI的吸油性低于浓缩蛋白PPC的吸油性。美藤果脱脂粉PPC和PPI的吸油性都达到最大值时的温度，约50℃，其最大值分别为293%和165%，比赵旻等[3]的云南星油藤种仁蛋白的吸油性稍大，比一般的植物蛋白要高。美藤果PPC具有较好的吸油性，因为其美藤果种仁脱脂粉浓缩蛋白质本身的疏水性基团能与油分子表面接触，使其接触面积更大，吸油性更好。当温度继续升高时，蛋白质会出现一定变性，从而使得蛋白质凝聚结块，就会在一定程度上减少与油接触的表面积，减少吸油量。另外，随着温度的升高，油的粘度也会随之降低，这些因素都会减弱油与美藤果蛋白分子与油分子的结合能力，从而导致蛋白质吸油性下降。

2.5 2种方法得到的蛋白的溶解性比较

从图5看出，在其等电点附近，即pH约为4.5时，美藤果脱脂粉溶解性最差。因为此时美藤果蛋白质分子间的作用力最小，而在其凝聚而析出的蛋白质沉淀最多，其蛋白质的溶解性也达到最低[15-19]。随着pH增加，美藤果脱脂粉蛋白质的溶解性也逐渐升高。在本实验的pH范围内，PPC比PPI的溶解性更低 。当酸碱度在等电点附近的pH时，可以明显看出这2种美藤果蛋白溶解性的差异。

2.6 2种方法得到的蛋白的起泡性比较

图6表示2种不同方法提取的蛋白在不同时间的起泡性，很显然，PPC的起泡性要明显高于PPI。这可能是美藤果脱脂粉PPC比PPI更容易吸附在水面上，从而进一步降低了其表面的张力，在受到高速匀浆机的搅打过程中，反而更容易形成泡沫，所以会得出反常的实验现象[19]。

2.7 2种方法得到的蛋白的粘度性比较

由图7可知，PPI的黏度要高于PPC。当温度不断升高时，2种不同美藤果蛋白溶液的黏度也会随温度的升高而降低。可能是温度升高，分子间作用减少，粘度降低。而且当温度升高到一定程度时，美藤果脱脂粉蛋白会产生变性，使疏水作用力不断增大，从而进一步导致蛋白质溶液的黏度下降[20]。2种不同的美藤果脱脂粉蛋白在温度升高时黏度都会降低。

3 讨论与结论

实验和数据分析结果表明，美藤果种仁脱脂粉主要成分为：粗蛋白约63.62%、粗灰分约6.32%、粗纤维约5.47%、粗脂肪约2.06%、水溶性糖约9.58%；其中，粗蛋白含量高，有很大利用价值。美藤果种仁蛋白等电点在pH约4.5左右。研究范围内，在吸水性、吸油性方面，美藤果酶法除杂提取浓缩蛋白粉末（PPC）比碱提取蛋白粉末（PPI）略好；2种方法提取蛋白粉的溶解性都是随PH的升高呈先降低后升高的特点；PPI比PPC有较好的溶解性，粘度也略高于浓缩蛋白。在起泡性方面，PPC优于PPI；PPC和PPI的吸油性都达到最大值时的温度，约50℃，其最大值分别为293%和165%；如果需要吸水性、吸油性、起泡性等功能性质的蛋白质时，可以用PPC提取美藤果种仁的蛋白质。如果需要溶解性、粘度良好的功能性质的蛋白质时，可以用PPI方法提取获得美藤果种仁的碱提蛋白质。

致 谢 感谢中国科学院西双版纳热带植物园热带植物资源可持续利用重点实验室的赵晏、张萍、李秀芬、许又凯等老师在论文完成过程中提供的帮助，特此致谢！

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