张怡 蒋姝乐 杜尔罡

[摘要] 目的 探讨TNF-α在干眼症患者结膜细胞的表达。 方法 选择2014年1月～2015年6月确诊为干眼症患者28例以及以眼干为主诉确诊为非干眼症的31例为研究对象。比较两组BUT水平、基础泪液分泌试验（Schirmers Test）结果，TNF-α定量PCR检测结果，分析干眼症患者TNF-α与BUT水平、Schirmers Test结果的相关性。 结果 干眼症组患者BUT水平、Schirmers Test结果显著低于对照组，差异有高度统计学意义（P<0.01）。干眼症组患者TNF-α mRNA定量PCR检测结果（1.55±0.26），对照组（0.99±0.18），两组比较差异有统计学意义（P<0.01）。干眼症患者TNF-α mRNA与BUT具有显著负相关的关系（r=-0.691）。干眼症患者TNF-α mRNA与Schirmers Test具有显著负相关的关系（r=-0.917）。 结论 干眼症患者结膜细胞TNF-αmRNA显著升高，并且与BUT水平、Schirmers Test结果呈显著负相关的关系，说明TNF-α参与了干眼症的发生及发作，与患者病变严重程度具有密切相关性。

[关键词] TNF-α；干眼症；结膜细胞；基础泪液分泌试验；泪膜

[中图分类号] R777.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）08-0008-03

干眼症最常见的病理表现是炎症，泪液质、量异常，泪液流体动力学异常，泪膜稳定性破坏。患者典型的症状包括眼部异物感、眼表易激惹状态等。目前干眼症的发生机制还不十分明确，目前认为，内分泌失调、高龄、自身免疫性疾病、角膜神经异常、维生素缺乏、感染、药物、隐形眼镜等多种因素导致。炎症在干眼症的发生及发展过程中发挥了重要的作用[1，2]。泪膜稳定性遭到破坏，渗透压增高，炎症级联反应启动。肿瘤坏死因子α（TNF-α）是重要的炎性因子，研究显示患者泪液、结膜上皮细胞中TNF-α水平增加。本研究分析TNF-α在干眼症患者结膜细胞的表达，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014年1月～2015年6月在我院以眼干为主诉诊治的患者74例为研究对象。初步排除结石、倒睫、睑缘炎、角结膜异物，眼烧伤等疾病，主诉为视疲劳、眼干、眼痛、微光、干涩、眼红、烧灼感等。74例患者通过前期确诊为干眼症及非干眼症患者中进行筛选。干眼症组：患者有视疲劳、眼干、眼痛等症状，BUT低于6 s，Schirmers Test 10mm/5min以下，眼部无手术史，无角膜接触配镜佩戴史。符合标准者共28例，其中男11例，女17例，年龄36～69岁，平均（51.8±10.6）岁。非干眼症对照组：BUT超过10 s，Schirmers Test 10 mm/5 min以上，无角膜接触配镜佩戴史，无眼部手术史，无结膜炎。符合标准者共31例，其中男13例，女18例，年龄35～66岁，平均（50.9±10.3）岁。两组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 相关检查

1.2.1 泪膜破裂时间测定（BUT） 向患者结膜囊滴入2%荧光素钠1滴，眨眼数次，使荧光素均匀涂布在角膜，裂隙灯下，采用钴蓝滤光片观察、记录最后一次眨眼，到出现第一个随机分布的黑斑时间，10 s以下为正常。检测结束后，采用0.25%氯霉素冲洗。

1.2.2 Schirmers Test 结膜囊内滴入眼表面麻醉剂，取Schirmers Test滤纸条，在下眼睑缘外2/3，轻闭眼睛，避免解除眼球，5 min后取出，记录泪液浸湿长度，记录度数，10 mm以下为阳性。

1.2.3 结膜印记细胞学检查 表面麻醉剂进行眼表麻醉，高压灭菌的硝酸纤维膜圆形纸片，贴在距角膜缘2 mm上方球结膜表面，消毒玻棒轻轻加压，然后撕下，投入TRIzol裂解液中，4℃保存待用。

1.2.4 TNF-α mRNA实时定量PCR测量 ①提取RNA。取泡有硝酸纤维膜TRIzol裂解液，加氯仿，静止5 min，4℃，12 000转/min离心，15 min，取上清，加入EP管，加异丙醇，混匀，静置5 min；4℃，12 000转/min离心，10 min，加75%酒精清洗，4℃，7 500转/min，离心5 min，晾干；用RNase-free水溶解RNA，-20℃保存。②将提取的RNA通过M-MLV逆转录酶逆转录为cDNA。③实时荧光定量PCR：转录体系：逆转录模板2 μL，super mix 10 μL，primer 1 μL，H2O，定容至20 μL；步骤：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，循环40次，75℃延伸50 s。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0统计学软件进行分析，计数资料采用χ2检验，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，相关性分析采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组BUT及Schirmers Test结果比较

见表1。干眼症患者BUT水平、Schirmers Test结果显著低于对照组，差异有高度统计学意义（P<0.01）。

2.2 两组TNF-α mRNA定量PCR检测结果

干眼症组患者TNF-α mRNA定量PCR检测结果（1.55±0.26），对照组（0.99±0.18）。两组比较，差异有高度统计学意义（t=9.696，P<0.01）。见图1。

2.3干眼症患者TNF-α mRNA与Schirmers Test的相关性

见图2。干眼症患者TNF-α mRNA与Schirmers Test具有显著负相关的关系（r=-0.917）。

2.4 干眼症患者TNF-α mRNA与BUT的相关性

见图3。干眼症患者TNF-α mRNA与BUT具有显著负相关的关系（r=-0.691）。

3讨论

干眼症又称为干燥性角结膜炎，是多因素疾病，设计泪液及眼球标本，患眼有畏光、异物感、瘙痒、视力波动等症状。干眼症随着年龄的上升，患病率有显著上升。轻度干眼症患者主要是刺激症状，重度者可出现感染、角膜新生血管形成、角膜混浊、角膜溃疡，甚至穿孔失明。干眼症的发病机制复杂，目前认为，内分泌失调、高龄、自身免疫性疾病、角膜神经异常、维生素缺乏、感染、药物、隐形眼镜等多种因素导致。目前学界普遍认为炎症在干眼症的发生及发展过程中能发挥重要的作用[3，4]。

人类的眼表系统包括结膜、角膜、泪腺、鼻泪管、睑板腺，以及相关联的结缔组织。各个器官之间分布连续的上皮细胞，互相联系的神经系统、免疫反应、内分泌调节、血液循环等，共同调节泪腺分泌、泪膜的稳定性。在这个调节过程中，任何一个环节发生损伤，均会导致破坏眼表微环境的平衡，破坏泪膜稳定性，渗透压失衡，眼表炎症细胞浸润。干眼症患者眼表皮上皮细胞暴露在高渗的泪液中，启动促炎细胞因子，趋化因子等炎症介质，炎症介质激活iAPC，诱导其迁移至淋巴组织，在淋巴结内吸引幼稚T细胞，促进自身反应性Th1细胞、Th17细胞等T细胞亚群增殖[5，6]。Th1细胞分泌TFN-γ，上调趋化因子、趋化因子受体、ICAMs，促进IL-17的分泌，进一步导致基质金属蛋白酶、促炎细胞因子的释放，导致上皮损伤[7，8]。干眼症患者炎性浸润、渗透压增加、机械损伤等均会导致促炎细胞因子上调。有学者研究结果显示，干眼症患者结膜上皮细胞的TNF-α、IL-1、IL-6、TFGF-1等表达升高[9]。在本次研究中，我们采用实时PCR方法检测结膜上皮细胞TNF-α mRNA进行定量分析，结果显示患者TNF-α mRNA表达显著高于对照组，说明TNF-α参与了干眼症的发生。

干眼症眼表的炎症状态是持续免疫细胞浸润的结果，角膜细胞CD4+T细胞、CD11b+单核细胞激活、局部浸润。干燥因素导致炎性细胞因子分泌，尤其是结膜组织IL-1、IL-6、TNF-α释放。成熟的长远呈递细胞刺激幼稚T细胞，诱导Th17细胞分泌IL-17、TH1细胞分泌IFN-γ。IL-17释反作用与Th17细胞，其通过TGF-β活性，拮抗调节性T细胞的功能，基质金属蛋白酶、炎性细胞因子分泌等导致上皮细胞损伤[10-12]。结膜部分上皮对外开放，上皮细胞内有活跃的离子通道运输、耦合渗透作用，以负责盐水交换，维持电解质平衡，渗透压正常，对维持眼表的湿润具有重要的作用。穹窿结膜、睑结膜、球结膜、泪腺中的离子通道表达不同，除泪腺以外的眼表组织中，广泛存在上皮钠通道，而穹窿结膜内离子转运最为活跃。

TNF-α是一种重要的炎性细胞因子，是一种内源性致热源，主要由巨噬细胞分泌，具有导致细胞凋亡，导致发热等作用，也会启动正常及异常的免疫应答等细胞因子，通过诱导IL-1、IL-6等细胞因子，导致败血症，引起炎性细胞的募集、血管通透性改变、恶病体质等[13]。有学者认为，促炎因子抑制释放神经递质，如IL-6能够抑制乙酰胆碱、肌间去甲肾上腺素的释放。炎性细胞因子还能够诱导包膜蛋白质角化，参与角化性眼表疾病的病理变化[14，15]。TNF-α是炎症强效诱导剂，刺激产生多种促炎细胞因子。

Schirmers Test、BUT是临床上辅助诊断干眼症的主要方法，但也有部分患者体征、症状不一致，这种情况下，能够结合病程、炎症标志物来诊断，可使治疗更有针对性。Schirmers Test反映了基础泪液分泌情况[16，17]。本次研究中，干眼症患者Schirmers Test结果显著低于正常对照组，说明干眼症患者泪液分泌减少，但TNF-α水平增加，进一步分析TNF-α水平与Schirmers Test结果呈显著负相关的关系，说明干眼症患者TNF-α水平越高，泪液分泌越少，患者病情越重[18，19]，BUT反映了泪膜稳定性[3]。在本次研究中，干眼症患者BUT结果显著低于对照组，说明干眼症患者泪膜稳定性较差。进一步分析，患者TNF-α水平越高，泪膜稳定性越低，两者呈显著负相关的关系，说明干眼症患者TNF-α水平越高，病情越重。

综上所述，干眼症患者TNF-α表达显著升高，并且与患者Schirmers Test、BUT结果具有负相关的关系，说明TNF-α参与了干眼症的发生及发作过程，与病情的严重程度密切相关[20]。

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（收稿日期：2015-12-14）