杨接来　程冬冬　朱斌　闫明霞　姚明　杨庆诚

200233，　　上海交通大学附属第六人民医院骨科(杨接来、程冬冬、朱斌、杨庆诚)；200032，　　上海市肿瘤研究所(闫明霞、姚明)



XBP1在氯化钴诱导骨肉瘤细胞缺氧环境下抗凋亡作用实验研究

杨接来程冬冬朱斌闫明霞姚明杨庆诚

200233，上海交通大学附属第六人民医院骨科(杨接来、程冬冬、朱斌、杨庆诚)；200032，上海市肿瘤研究所(闫明霞、姚明)

【摘要】目的探讨在氯化钴诱导骨肉瘤细胞缺氧情况下，X盒结合蛋白1(XBP1)在骨肉瘤细胞中表达量的变化、其对细胞凋亡的影响及与低氧诱导因子(HIF)-1α信号转导通路的关系。方法通过氯化钴诱导骨肉瘤MNNG、MG-63细胞达到模拟缺氧状态，通过实时聚合酶链式反应(PCR)检测不同时间、不同氯化钴浓度下HIF-1α和XBP1的表达情况；采用流式细胞仪检测骨肉瘤细胞凋亡率；采用siRNA干扰技术，下调XBP1。实验将骨肉瘤细胞分为干扰组(经XBP1 siRNA转染骨肉瘤细胞)和空白对照组(未经XBP1 siRNA转染骨肉瘤细胞)。结果XBP1表达具有氯化钴浓度和时间依赖性：一定范围内，随着氯化钴浓度增高和时间延长，XBP1表达升高；敲除XBP1后，干扰组骨肉瘤细胞凋亡率明显高于对照组(P>0.05)；PCR检测 HIF-1α及下游靶基因mRNA表达无明显变化(P<0.05)。结论XBP1在氯化钴诱导缺氧的骨肉瘤细胞中表达明显增高，其对骨肉瘤细胞在缺氧环境下抗凋亡有明显作用，其抗凋亡作用与HIF-1α信号转导通路无直接关联，具体机制有待进一步研究。

【关键词】骨肉瘤；X盒结合蛋白1；低氧诱导因子-1α信号转导通路；氯化钴；缺氧

恶性肿瘤的形成原因为肿瘤细胞无限增殖，细胞增殖过快必将导致局部组织营养不足。肿瘤细胞产生应激反应，激活各种适应性通路，其中由内质网跨膜感受器肌醇需要酶(IRE)1及其下游底物X盒结合蛋白(XBP)1介导的未折叠蛋白系统或内质网应激反应为非常重要的适应性通路[1]。XBP1参与多种生理、病理过程，如脂肪形成和脂质代谢，在调控未折叠蛋白方面发挥重要作用[2]。XBP1在某些肿瘤形成过程中也起着重要作用[3-4]。缺氧为导致实体瘤内质网应激的常见因素之一。多项研究[5]表明，肿瘤缺氧预示着更高的局部复发率和远处转移率，以及更低的远期生存率。抗肿瘤药物的疗效与缺氧密切相关：一方面，药物在缺氧缺血组织中很难达到有效浓度，对肿瘤细胞的杀伤力下降；另一方面，缺氧环境能够滤出恶性程度更高和转移潜能更大的肿瘤细胞，进而使肿瘤细胞产生耐药性。研究[4]表明，XBP1可通过低氧诱导因子(HIF)-1α信号转导通路促进肿瘤形成，在三阴性乳腺癌中，XBP1与HIF-1α不直接发生作用，两者在细胞内共同表达，共同作用于HIF-1α下游的靶分子，进而发挥相应的促癌作用。近年来，关于HIF-1α在促肿瘤增殖、肿瘤转移、血管形成、耐药等方面的研究较多。作为内质网上的应激分子，XBP1在缺氧环境下对肿瘤的发生发展有重要作用，但XBP1在骨肉瘤中的作用及参与的调节机制尚未阐明。本文旨在通过氯化钴化学诱导骨肉瘤MNNG、MG-63细胞缺氧研究XBP1在骨肉瘤细胞缺氧状态下的抗凋亡作用，进而探讨相应作用机制。

1材料与方法

1.1材料

细胞株、试剂和主要仪器：骨肉瘤细胞株MNNG、MG-63细胞(上海中科院细胞库)；Dulbecco改良的Eagle培养液(DMEM)、新生胎牛血清(美国Hyclone公司)；氯化钴六水合物(美国Sigma公司)；实时定量聚合酶链式反应(PCR)试剂盒(日本TaKaRa公司)；FACSort 流式细胞仪(美国BD公司)。

siRNA 试剂：纯化siRNA(上海拓然生物科技有限公司)。XBP1转染组siRNA序列：正义链5′-CACCCUGAAUUCAUUGUCUdTdT-3′，反义链5′-AGACAAUGAAUUCAGGGUGdTdT-3′。对照组siRNA序列：正义链5′-UAGCGACUAAA-CACAUCAAUU-3′，反义链5′-UUGAUGUGU-UAGUCGCUAUU-3′。

1.2实验分组

对照组：未经XBP1 siRNA转染的MNNG细胞和MG-63细胞。

实验组：即干扰组，经XBP1 siRNA转染的MNNG细胞和MG-63细胞。

1.3方法

1.3.1细胞培养

在5%CO2、37℃的培养箱中用含10%胎牛血清和双抗DMEM培养液(青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL)进行细胞培养。采用0.25%的胰酶消化、传代。

1.3.2氯化钴诱导细胞缺氧

培养液中加入不同浓度氯化钴(50、150、200、400 uM)，培养细胞24 h，检测目的分子XBP1及HIF-1α表达量变化。在最佳浓度(MNNG细胞为200 uM, MG-63细胞为50 uM)下取不同时间段(6、12、18、24、48 h)检测目的分子表达。

1.3.3定量和纯度检测

实时定量PCR Trizol法提取总RNA，用分光光度计进行定量和纯度检测。①逆转录：将逆转录相关反应液充分混匀，放置于PCR仪上，反应条件为37℃、15 min，85℃、5 s,将得到的cDNA储存于-20℃条件下备用。②逆转录PCR：将逆转录得到的cDNA原液以1∶10的比例稀释，采用SYBR Premix Ex Taq Kit(宝生物染料法荧光定量试剂盒),各基因引序列见表1。反应条件为95℃预变性10 s，共1个循环；95℃、5 s，60℃、31 s，共40个循环。③定量：以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参照，采用2-△△Ct法，计算每个基因的相对表达量。对溶解曲线进行分析，确定扩增产物为单一的目的片段。实验重复3次。

表1　各基因引物序列

1.3.4siRNA转染

①铺板：将骨肉瘤细胞按每孔2×105个铺于六孔板，待细胞贴壁。②稀释：使用进口无菌枪头及离心管，吸出完全培养液，每孔加入1.5 mL纯DMEM培养液。取5 μL siRNA用250 μL纯DMEM孵育。另取5 μL lipo 2000转染试剂加入250 μL纯DMEM培养液。③转染：将上面2种孵育培养液均匀混合，静置20 min，滴至六孔板，轻轻摇匀。④换液：转染后6 h更换新鲜完全培养液，培养48 h，缺氧处理(MNNG细胞为200 uM, MG-63细胞为50 uM)24 h后进行下一步实验。

1.3.5检测细胞凋亡率

采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率，具体步骤如下。①铺板：骨肉瘤细胞按每孔4.0×105个铺于六孔板，待细胞贴壁。②消化：胰酶消化贴壁的MNNG及MG-63细胞，用1 mL磷酸盐缓冲液(PBS)吹打MNNG及MG-63细胞并转移至1.5 mL离心管，以2000 rpm离心5 min，弃PBS。③染色：每管加100 μL结合液吹打细胞，各加 5 μL Annexin V 及 5 μL PI染液，室温孵育15 min，避光操作。④流式检测：各管加 400 μL结合液，吹打混匀，转移至流式管检测凋亡率。

1.4统计学分析

2结果

2.1氯化钴诱导缺氧后HIF-1α mRNA变化

HIF-1α mRNA在常氧下表达较低，接受氯化钴诱导缺氧后其相对表达量发生变化(图1)。

图1氯化钴诱导缺氧后HIF-1α mRNA变化a. MNNG细胞在氯化钴浓度为200 uM情况下，随时间推移，其HIF-1α表达量变化b. MG-63细胞在氯化钴浓度为50 uM情况下，随时间推移，其HIF-1α表达量变化c. MNNG细胞经不同浓度氯化钴处理24 h，随氯化钴浓度增加，其HIF-1α表达量变化d. MG-63细胞经不同浓度氯化钴处理24 h，随氯化钴浓度增加，其HIF-1α表达量变化

2.2氯化钴诱导缺氧后XBP1 mRNA变化

相比于HIF-1α，缺氧导致的XBP1变化相对滞后，对缺氧引起变化的阈值更高,且MG-63细胞对氯化钴诱导的缺氧更敏感(下页图2)。

2.3对比结果

流式细胞仪检测缺氧条件下抑制XBP1表达对细胞凋亡的影响结果显示：在氯化钴导致缺氧处理24 h后，干扰组凋亡率明显低于对照组(P<0.05，下页图3)。图3a、3b、3d、3e为细胞流式凋亡图，采用PI和Annexin V双染色法，G1象代表坏死细胞，G2象代表中晚期凋亡细胞，G3象代表正常活细胞，G4代表早期凋亡细胞。图3c为MNNG细胞各象比例的柱状图，其中干扰组的中晚期凋亡率(G2)明显高于对照组；图3f为MG-63细胞各象比例的柱状图，其中干扰组的中晚期凋亡率(G2)明显高于对照组。

图2氯化钴诱导缺氧后XBP1 mRNA变化a. MNNG细胞在氯化钴浓度为200 uM情况下，随时间推移，其XBP1表达量变化b.MG-63细胞在氯化钴浓度为 50 uM情况下，随时间推移，其XBP1表达量变化c. MNNG细胞经不同浓度氯化钴处理24 h，随氯化钴浓度增加，其XBP1表达量变化d. MG-63细胞经不同浓度氯化钴处理24 h，随氯化钴浓度增加，其XBP1表达量变化

图3MNNG细胞和MG-63细胞凋亡情况a. 对照组MNNG细胞凋亡情况b. 干扰组MNNG细胞凋亡情况c. MNNG细胞各象比例的柱状图d. 对照组MG-63细胞凋亡情况e. 干扰组MG-63细胞凋亡情况f. MG-63细胞各象比例的柱状图

*表示P<0.05

2.4氯化钴抑制XBP1 mRNA表达对HIF-1α信号转导通路上下游的影响

逆转录PCR结果显示，氯化钴处理24 h后，干扰组和对照组HIF-1α信号转导通路上的靶基因表达量无明显差异(P>0.05，图4、5)。下调MNNG细胞中XBP1表达(图4a)，对照组和干扰组HIF-1α相对表达量无明显变化，HIF-1α下游分子PDK1、VEGFA、CAIX、PGK1相对表达量变化不明显(图4b～4f)。下调MG-63细胞中XBP1表达(图5a)，对照组和干扰组HIF-1α相对表达量无明显变化,HIF-1α下游分子PDK1、VEGFA、CAIX、PGK1相对表达量的变化不明显(图5b～5f)。

图4　氯化钴抑制XBP1 mRNA表达对MNNG细胞中HIF-1α信号转导通路上下游的影响

*表示P<0.05

图5　氯化钴抑制XBP1 mRNA表达对MG-63细胞中HIF-1α信号转导通路上下游的影响

*表示P<0.05

3讨论

骨肉瘤是最常见的好发于青少年的骨恶性肿瘤之一，其发生与肿瘤微环境改变、癌基因突变等因素有关，但具体机制尚未明确[6]。XBP1作为内质网上的未折叠蛋白，在许多细胞正常代谢及病理过程中都发挥重要作用。正常情况下，XBP1的持续表达对浆细胞分化、脂质代谢等活动起重要作用[2,7]；病理状态下，XBP1对动脉粥样硬化、缺血性疾病及癌症的发生发展起重要作用[1]。研究[3,8]表明，在骨髓间充质干细胞(BMSC)中XBP1高表达对破骨细胞生成有重要作用；而多发性骨髓瘤的重要成分为BMSC，因此XBP1过表达对多发性骨髓瘤具有促进作用，其有望成为多发性骨髓瘤的有效治疗靶点。其他肿瘤如肝癌和结肠癌中，也存在XBP1的激活及其促癌作用的报道，但具体机制尚不清楚[9]。

研究[10]表明，XBP1可通过磷酸酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合酶激酶-3β/E2F转录因子2(P13k/Akt-1/GSK3β/E2F2)信号转导通路促进内皮细胞增殖和新生血管形成。另一项研究[11]表明，XBP1可与组蛋白去乙酰(HDAC)3一起通过核因子红细胞衍生物(Nrf)-2介导的血红素加氧酶(HO)-1和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)依赖的Akt-1蛋白，调控内皮细胞抵抗氧化应激。在骨代谢方面，XBP1能够调节侏儒相关转录因子Runx2，对成骨细胞和软骨细胞分化起作用[12]。虽然以上研究均针对正常细胞，但可为XBP1在肿瘤中的研究提供更多思路。

HIF-1α对多种肿瘤具有促进作用，尤其在骨肉瘤中的作用已有报道[13-14]。HIF-1α对于肿瘤应对缺氧环境起着非常重要的作用，同样作为应激相关分子，XBP1在细胞缺氧、缺糖等条件下应激反应表达也会增加。早期研究[15]表明，XBP1对人纤维肉瘤细胞的生长必不可少，且缺氧环境下XBP1可减少细胞凋亡，对肿瘤细胞具有保护作用。肿瘤细胞单凭HIF-1α升高不足以抵抗缺氧等应激反应，只有与XBP1协同作用，抵抗应激作用才会增强。缺氧环境下XBP1和HIF-1α的表达均升高，以往研究认为两者是独立的，可能通过不同机制通路发挥作用，但近期研究表明，XBP1与HIF-1α在三阴性乳腺癌中存在一定交集。

尽管XBP1在肿瘤中有一定研究，但在骨肉瘤中的报道却较少[16]。本研究采用氯化钴构建骨肉瘤缺氧模型，在通过不同氯化钴浓度和不同时间处理后，发现XBP1 mRNA的表达明显升高，与HIF-1α升高趋势相仿，虽然XBP1 mRNA对缺氧的敏感性逊于HIF-1α，但其升高后维持时间长于HIF-1α，推测XBP1在骨肉瘤细胞中应对极度缺氧环境时更具优势。凋亡实验表明，XBP1干扰组的凋亡率明显高于对照组，推测XBP1对骨肉瘤细胞在缺氧环境中具有保护作用。

为了进一步阐述XBP1在骨肉瘤细胞中抵抗缺氧的相关机制，探讨其与HIF-1α信号转导通路的关系，在缺氧模拟的骨肉瘤细胞中下调XBP1 ,结果并未发现HIF-1α及下游靶基因有明显变化，推测骨肉瘤细胞在应对缺氧等应激时，XBP1和HIF-1α升高可能是一个独立过程，与之前在其他肿瘤的报道一致，单凭HIF-1α激活不足以抵抗缺氧等应激反应，XBP1在骨肉瘤应对缺氧时发挥的作用机制可能与HIF-1α信号转导通路无直接关联。其他信号通路如Nrf-2/Ho-1、P13k/Akt等信号转导通路在内皮细胞中有所报道，但是否在骨肉瘤细胞中起作用，还有待验证。

综上所述，缺氧环境下XBP1在骨肉瘤细胞中的表达明显升高，且对骨肉瘤细胞抵抗缺氧具保护作用，推测XBP1可促进骨肉瘤发展，有望为临床骨肉瘤靶向治疗提供一种新思路。

参考文献

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(收稿：2015-11-18；修回：2015-12-14)

(本文编辑：李昱霏)

Experimental study of the anti-apoptosis effect of XBP1s on osteosarcoma cells under CoCl2-induced hypoxic conditionYANGJie-lai1,CHENGDong-dong1,ZHUBin1,YANMing-xia2,YAOMing2,YANGQing-cheng1.

DepartmentofOrthopaedics,theSixthPeople’sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity1,Shanghai200233,China；ShanghaiCancerInstitute2,Shanghai200032,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression level, anti-apoptotic effect and association with hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) signaling of X-box binding protein 1 (XBP1s) in osteosarcoma cells under CoCl2-induced hypoxic condition. Methods CoCl2 was used to simulate hypoxic environment for MNNG and MG-63 cells. The expression of XBP1s and HIF-1α mRNA of osteosarcoma cells were detected by real-time polymerase chain reaction (PCR) for treatment of different CoCl2 concentration and time span. Flow cytometry was utilized to measure the apoptotic rate of osteosarcoma cells. The siRNA interfering technique was used to reduce the expression of XBP1s. The osteosarcoma cells were divided into the XBP1s-siRNA transfected group and the un-transfected group. Results XBP1s expression was CoCl2-concentration and time-dependent, which increased with the raised CoCl2 concentration and prolonged time in a certain range. After knockdown of XBP1s, the cell apoptotic rate of osteosarcoma cells in the hypoxic group was significantly higher than that in the control group (P>0.05). However, the PCR results showed that there was no significant changes of HIF-1α and its downstream targeted genes after knockdown of XBP1s (P<0.05). Conclusion XBP1s could be increased remarkably in osteosarcoma cells after CoCl2-induced hypoxic treatment. It has anti-apoptotic effects on osteosarcoma cells under hypoxic condition. However, there is little relationship between XBP1s and HIF-1α signaling pathway. The specific mechanism for XBP1s acting as an anti-apoptotic gene in osteosarcoma is needed further deeper investigation.

【Key words】Osteosarcoma; X-box binding protein 1;Hypoxia inducible factor-1α signaling pathway; CoCl2; Hypoxic

Corresponding author:YANG Qing-chenE-mail: tjyqc@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.02.013

通信作者：杨庆诚E-mail: tjyqc@163.com