王锐 安晓丽 梁秋波 张道旭 李郑武

（哈药集团技术中心 黑龙江哈尔滨 150025）

抗人绒毛膜促性腺激素β亚单位羧基末端肽（hCG β-CTP）单克隆抗体制备及初步鉴定

王锐 安晓丽 梁秋波 张道旭 李郑武

（哈药集团技术中心 黑龙江哈尔滨 150025）

本研究以重组人促红素-CTP融合蛋白（EPO-CTP）进行真核表达，获得纯品蛋白，免疫小鼠，采用淋巴细胞杂交瘤技术，获得1株可稳定分泌抗人绒毛膜促性腺激素β亚单位羧基末端肽（hCGβ-CTP）的杂交瘤细胞株，命名为E4。ELISA鉴定结果表明，单抗的亚型为IgG1，轻链为K链，腹水效价都在5×10-5以上。从而为验孕产品特异性的提高和以连接CTP的融合蛋白药物的研制提供物质基础。

抗人绒毛膜 hCGβ-CTP 单克隆抗体

人绒毛膜促性腺激素（human chorionie gonadotrophin，HCG）是人类受孕后胎盘合体滋养层细胞分泌的维持正常妊娠必需的一种糖蛋白激素。HCG分子含有两个亚基，分别为α和β亚基，其生物学活性和免疫学特性由β亚基决定。在妊娠早期HCG的浓度迅速增高，监测尿中的HCG即可证实妊娠。hCG的β亚基羧基端28残基组成的28肽是hCG分子所特有的片段，其糖含量高，可以延长体内半衰期，现很多蛋白药物与其连接，以达到长效机制。获得抗hCGβ羧基末端肽单克隆抗体可以进一步提高验孕产品检测的敏感性和特异性，并为避孕疫苗的研制和连有CTP的融合蛋白药物的分析奠定基础。

1 材料

重组人促红素-CTP融合蛋白：本室提供；胎牛血清，1640培养基，H T，H A T，聚乙二醇：S i g m a公司；鼠源单抗亚类试剂盒：SouthernBiotech；其余生化试剂均为分析纯。

2 方法

（1）动物免疫。按照萨姆布鲁克J等［1］报道的方法，将重组人促红素-CTP融合蛋白作为免疫蛋白。以1μg/μL的浓度，对6只7周龄巴比西小鼠进行免疫，每只接种100μL，间隔2周免疫一次，共3次，细胞融合于最后一次免疫后7天进行。（2）ELISA方法的建立。以重组人促红素-CTP融合蛋白为抗原包被ELISA板，用碳酸盐缓冲液稀释抗原，方阵法确定蛋白最佳包被浓度和阴阳性血清的最佳稀释倍数，经HRP标记的山羊抗鼠IgG作用，邻苯二胺底物显色，判定结果。判定标准为阳性血清孔的OD492值接近1.0，阴性血清OD492值＜0. 2，P/N≥2.1。（3）细胞融合及筛选。抗血清效价检测于第3次免疫后7天进行。取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，按常规方法进行融合，HA T筛选融合细胞，采用有限稀释法对阳性克隆进行筛选，达到1 0 0%阳性者扩大培养，建株保存。（4）单抗亚类鉴定。按SouthernBiotech公司亚类试剂盒说明书用ELISA方法进行检测。（5）腹水制备。采用体内诱生腹水法，按常规方法制备腹水。用建立的ELISA检测方法测定单抗腹水效价，以P/N≥2.0的抗体最大稀释度作为效价终值。（6）抗体识别特异性鉴定。用杂交瘤细胞腹水纯化后蛋白做免疫印迹分析，结果证实本试验所获得的单抗能与人绒毛膜促性腺激素β亚单位羧基末端肽反应，说明筛选得到的单抗可以特异性识别人绒毛膜促性腺激素β亚单位羧基末端肽，进一步证实了所获得单抗的特异性。（7）杂交瘤细胞稳定性分析。对已获得的1株杂交瘤细胞进行30次传代，以免疫鼠血清为阳性对照，以空白鼠血清为阴性对照，收集细胞培养上清液并测其效价。

3 结果

（1）间接ELISA方法结果。将重组人促红素-CTP融合蛋白原液，分别以4μg/ml，2μg/ml，1μg/ml和0.5μg/ml的浓度包被ELISA板，阳性和阴性血清稀释倍数为1：100、1：500、1：1000，结果显示，抗原浓度在1μg/ml，血清稀释倍数为1/1000时，P/N≥2.1。（2）杂交瘤细胞的融合率。本试验经过3次细胞融合，细胞的融合率达到了85.8 %。（3）细胞株的建立。细胞融合后，判定为阳性的杂交瘤细胞经3次克隆筛选，获得能够稳定分泌抗人绒毛膜促性腺激素β亚单位羧基末端肽单抗细胞株，命名为E4。（4）单抗亚类鉴定。经单克隆抗体亚类鉴定试剂盒检测，所获杂交瘤细胞，均为IgG1型，且都是K轻链抗体。（5）单抗腹水效价测定。获得腹水电泳纯度在95%以上，经鉴定表明单抗腹水的间接ELSIA效价都在10-5以上。（6）单抗特异性鉴定。经SDS-PAGE电泳后，将转移至硝酸纤维素膜的蛋白进行单抗孵育。结果显示单抗能特异性的识别人绒毛膜促性腺激素β亚单位羧基末端肽。（7）细胞分泌抗体稳定性分析结果。杂交瘤细胞株经30次传代，能持续并稳定分泌抗体。

4 讨论

本研究以重组人促红素-CTP融合蛋白为免疫原，免疫巴比西小鼠，获得一株抗人绒毛膜促性腺激素β亚单位羧基末端肽单抗，命名为E4。经鉴定，该株单抗亚类为IgG1，轻链为K链；杂交瘤细胞连续传代30次，其分泌抗体的能力较稳定；腹水效价均达到10-5以上；免疫印迹实验表明，该株单抗能够特异性识别人绒毛膜促性腺激素β亚单位羧基末端肽。目前市场上的验孕产品，捕获抗体大多是针对非CTP段抗原表位的抗体，而人的hCGβ与LHβ同源非常高［2］，主要差异就在CTP段，这会给检测造成假阳性。因此CTP单抗的研制，对于验孕产品的特异性提高有很大帮助。

目前治疗性生物制品的研发日趋火热，为了提高蛋白类药物的半衰期，CTP短肽成为各大药企研究热点。鉴于此我们研究并制备了人绒毛膜促性腺激素β亚单位羧基末端肽单抗，从而为验孕产品和长效药物的研制都提供了物质基础。

［1］萨姆布鲁克 J，拉塞尔 DW（黄培堂，等译）.分子克隆实验指南［M］.北京：科学出版社，2002，1474-1480.

［2］黄树峰.综述 姜卫国 审枝.人绒毛膜促性腺激素测定在妇产科的应用（200605）.

S859.2

A

1674-2060（2016）02-0202-01