潘磊庆，张　伟，于敏莉，孙　晔，顾欣哲，马　龙，李紫君，胡鹏程，屠　康※（.南京农业大学食品科技学院，南京0095；.南京晓庄学院食品科学学院，南京7；.南京农业大学动物科技学院，南京0095）



基于高光谱图像的鸡种蛋孵化早期胚胎性别鉴定

潘磊庆1，张伟2，于敏莉3，孙晔1，顾欣哲1，马龙1，李紫君1，胡鹏程1，屠康1※
（1.南京农业大学食品科技学院，南京210095；2.南京晓庄学院食品科学学院，南京211171；3.南京农业大学动物科技学院，南京210095）

摘要：为了对鸡种蛋孵化早期胚胎进行性别鉴定，构建了高光谱图像采集系统，在400～1 000 nm范围内获取94枚种蛋孵化0～12 d的高光谱透射图像。分别在胚胎的圆头、中间、尖头3个部位选择感兴趣区域（region of interest，ROI），获取400～1 000 nm波段的响应信号，构建了支持向量机（support vector machine，SVM）、偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）和人工神经网络（artificial neural network，ANN）的鸡胚胎性别鉴定模型，并比较了不同孵化时间雌雄胚胎的鉴别准确率。试验结果表明，SVM模型、PLSDA模型和ANN模型均对孵化第10天种蛋中间部位检测效果最好。随后通过分析第10天种蛋中间部位光谱响应的差异，选取600～900 nm的光谱值构建胚胎性别鉴定模型，结果发现，3种模型的判别准确率均有上升，SVM模型和PLSDA模型预测集样本判别准确率均为75.00%，ANN模型预测集样本判别准确率达到82.86%。其中，ANN构建的种蛋孵化胚胎性别检测模型的整体效果优于SVM模型和PLSDA模型。结果表明高光谱图像技术在检测鸡种蛋孵化早期胚胎性别方面有一定效果，但种蛋蛋壳的个体差异会对鉴定准确率造成一定影响。

关键词：光谱分析；图像处理；无损检测；高光谱图像；鸡种蛋；孵化早期；胚胎；性别鉴定

潘磊庆，张伟，于敏莉，孙晔，顾欣哲，马龙，李紫君，胡鹏程，屠康.基于高光谱图像的鸡种蛋孵化早期胚胎性别鉴定[J].农业工程学报，2016，32（01）：181-186.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.01.025 http://www.tcsae.org Pan Leiqing, Zhang Wei, Yu minli, Sun Ye, Gu Xinzhe,Ma Long, Li Zijun, Hu Pengcheng, Tu Kang.Gender determination of early chicken hatching eggs embryos by hyperspectral imaging [J].Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering （Transactions of the CSAE）, 2016, 32（01）: 181-186.（in Chinese with English abstract）doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.01.025 http://www.tcsae.org

0　引言

家禽繁育中，雏禽的性别与经济效益密切相关。如在鸡蛋生产行业，母鸡的需求比例远高于公鸡，而在肉鸡行业，由于公鸡对饲料的利用率比母鸡高，生命力强，生长速度快，需求量更大[1]。但鸡蛋的孵化过程大约需要21 d，是一个耗时、耗能的过程。如果能在鸡种蛋孵化早期，检测胚胎性别，根据市场需求，控制孵化鸡雏的性别比例，从而大幅度节约生产成本，提高企业生产效率。种蛋性别鉴别传统方法是通过种蛋的外观和物理性质，但这种方法存在主观性强、准确率较低的缺点。另一方面，虽然在孵化后期16～18龄及出雏后鸡性别的传统鉴定方法非常有效，但是对这些鸡胚的处理是有悖于社会伦理、残忍的一件事情。而在孵化结束前尽早鉴别出鸡胚的性别并进行适当处理，能够兼顾实际生产和社会伦理的要求。因此，开放一种快速准确的识别孵化早期胚胎性别的方法，对整个家禽行业具有重要意义。

在已有的报道中，形状特征和内容物变化是家禽早期性别鉴定的主要方式。前者包括种蛋、胚线、性腺形态等。王家培等[2]利用蛋形指数对黔东南小香鸡种蛋进行性别鉴定初步研究，发现蛋形指数与性别有较为密切的相关性。唐剑林等[3]对孵化3 d的胚胎光照，发现雄胚的主血管明显且较粗，呈均匀分布；雌胚血管纤细，粗细均匀，分支较多，呈不规则状，从而对种蛋性别进行区分。后者如分子生物学方法、激素方法。Griffiths等[4]描述了利用PCR技术鉴定5～7 d鸡胚性别的方法。另外，雌激素是用来鸡胚性别鉴定的有效指标。美国Embrex公司已有两项专利（专利号分别为6506570和6510811）采用此方法。Steiner[5]等利用近红外成像系统，对从种蛋中取出的未孵化胚胎进行分析，结果表明近红外成像系统具有鉴别为孵化种蛋胚胎的潜在能力。虽然以上的研究有的结果很好，但是存在的缺陷也很明显，如PCR、DNA和红外光谱法方法操作步骤多，比较复杂，不宜在工业化生产实践中使用，而且都需要破坏种蛋，影响胚胎发育；而形态学的方法仅关注胚胎发育的外在形态，获取种蛋发育信息不全面，造成结果差异很大。从已有的研究也可以看出，胚胎性别鉴定的方法还是基于种蛋胚胎在发育过程中的胚相、理化方面的信息差异，而高光谱图像技术能够很好地反映胚胎发育的这些信息。

高光谱成像技术是集成了光学光谱和传统的成像技术的发明。应用高光谱成像系统既能提供样本的光谱信息又能提供空间信息这一优势，可以对农产品的质量进行快速准确评价。该系统可以通过收集全光谱信息结合多变量分析，检测样本的化学成分组成和浓度分布，弥补了单一光谱技术或成像技术的不足。该技术已经广泛应用于肉类、果蔬类品质等方面的检测[6-8]。因此，利用高光谱图像获取胚胎在孵化过程的信息，建立胚胎性别快速无损鉴别方法具有较大的研究价值。由于种蛋在孵化过程中，生理代谢和物质互相转化，蛋壳以及内部物质不断变化，同时伴随着一系列物理和化学性质的改变。因此，种蛋性别不同会造成其光谱值存在一定差别，通过一定的光谱分析方法有可能实现胚胎早期性别鉴别。

1　材料与方法

1.1试验材料

材料为白壳贵妃鸡种蛋，购于浙江省瑞安市一家珍禽种养场，共94枚。鸡种蛋在35℃、0.1%新洁尔灭溶液中浸泡5 min进行消毒处理，分别编号，晾干后放入孵化箱中，其中，孵化温度和相对湿度分比为37.8℃和65%。每2 d采集高光谱图像，连续检测12 d。为了更准确的判定胚胎性别，种蛋孵化到第16天，打开种蛋进行破坏性检测，人工判断胚胎性别。胚胎发育至第8天后，可以通过睾丸和卵巢形态进行性别区分，越到后期越容易实现人工判定。因为二者的差异在于：雌性胚胎右侧卵巢退化，使得卵巢两侧发育不平衡；而雄性胚胎两侧的睾丸发育对称[9]，可通过解剖后肉眼观察到雄性睾丸和雌性卵巢的形态变化来区分种蛋性别，如图1所示。本研究严格遵守实验动物护理和使用协议，该协议得到了南京农业大学动物实验伦理委员会的许可。本研究不涉及濒危和受保护物种，并尽可能减少动物的痛苦。

图1　鸡胚性别形态图Fig.1 Chicken embryo ovarian morphology diagram

1.2高光谱透射图像采集系统

高光谱成像系统检查鸡种蛋胚胎性别装置如图2所示。高光谱常用光源照射方式主要分为反射、半透射、透射3种。反射方式主要适用于检测样品表面缺陷，以及光穿透性较低的样品。透射主要适用于检测样品内部缺陷，以及光穿透性较高的样品[10-11]。半透射介于两者之间。本研究中采用透射方式。本试验中对种蛋胚胎采取横向放置采集图像。

试验中使用的高光谱成像系统由硬件和图像采集软件构成，硬件主要由相机（Imperx, ICL-B1620，有效波段范围为400～1 000 nm，光谱分辨率为2.8 nm）、光谱仪（Specim，ImSpector V10E）、焦距可变镜头、传送单元、可调光源（150 W卤素钨灯）和电脑构成。检测物体放置在电动平台上，通过控制平台设置合适的传送速度，使检测样品被光谱成像设备以线扫描的方式，记录空间和光谱信息。

图2　高光谱成像系统鸡胚胎性别鉴定的装置Fig.2 Schematic diagram of hyperspectral imaging system

1.3高光谱图像采集与校正

本文采用的高光谱成像系统图像采集软件Spectral Image（isuzuoptics, tw, China）由台湾五铃光学股份有限公司提供。在高光谱图像采集前，相机曝光时间、光强、焦距、图像存储大小和传送装置的速度等参数需要优化，以确保图像的质量[12]。经过预试验，最终确定曝光时间55 ms，采集速度1.6 mm/s，图像分辨率440×804。为了消除相机暗电流等噪声的影响，获取的原始图像（R0）需要进行黑白校正[13]。获取透射标准白色校正板（反射率99%）得到全白的标定图像W，盖上镜头盖，采集全黑的图像D，根据下式（1）得到校正的相对图像Rc：

式中R0为原始高光谱透射图像；D为全黑的标定图像；W为全白的标定图像；Rc为标定后高光谱透射图像[14]。

1.4数据处理和建模

本论文中运用ENVI软件对高光谱数据进行初步特征参数提取，包括光谱特征和图像特征。而后，提取的特征带入Matlab中进行图像处理和建模分析。本研究中，选取ROI（region of interest）区域大小为25×25像素点。为了更好的研究鸡胚胎不同部位对性别鉴定准确率的影响，分别在鸡胚胎横轴等间隔采集感兴趣区域，包含鸡胚胎的圆头、中间、尖头部位，具体如图3所示。

试验中，模型训练集样本62个，预测集32个。为充分比较不同的建模方法对预测性能的影响，运用了支持向量机（support vector machine，SVM）[15]、偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）[16]和人工神经网络（artificial neural network，ANN）[17]对数据进行建模分析。高光谱系统判断结果的准确率通过与人工判别相比较得出。

图3　鸡胚胎ROI区域位置选择Fig.3 ROI location in chicken embryo

2　结果与分析

2.1鸡胚胎不同孵化时间的光谱曲线变化情况

图4代表了不同孵化时间的鸡胚胎中间部位ROI区域的400～1 000 nm平均光谱曲线，可以看出光谱曲线之间存在明显的差异，说明胚胎孵化时间不同，光谱响应值也不同。反映了孵化过程中蛋壳结构、内部物质转化影响着光谱值的变化。随着孵化时间的延长，种蛋胚胎从种蛋圆头开始发育，逐渐向尖头延伸，鸡胚胎变的不透明，透射光谱值越来越低。

图4　不同孵化时间种蛋中间部位透射光谱曲线Fig.4 Transmittance spectral curves of middle part of eggs atdifferent hatching time

2.2不同性别鸡胚胎发育形态变化

图5为雌雄胚胎在不同孵化时间的高光谱图像。可以发现二者在图像方面没有明显的区别，无法应用图像特征进行性别鉴定。因此，后续研究通过对光谱数据的分析对种蛋胚胎进行性别鉴定。

图5　不同性别种蛋胚胎发育形态图Fig.5 Hatching eggs embryos diagram of different gender

2.3基于全波段光谱曲线和不同模型对种蛋胚胎性别鉴定

将全波段提取的ROI原始平均光谱数据作为输入变量，将胚胎性别作为输出变量，建立性别鉴定预测模型。不同部位光谱数据构建的SVM模型、PLSDA模型和ANN模型建模集和预测集判别准确率分别如图6a、6b和6c所示。其中，SVM模型参数为：核函数均为径向基函数，最优参数gamma值均为0.031 6，cost值均为100。构建的神经网络模型参数为：输入层为420，隐藏层数为1，隐藏层节点数为14，隐藏层激活函数为双曲正切；输出层个数为2，即雄性与雌性，输出层激活函数Softmax。

图6a中表明以种蛋胚胎圆头部位提取的ROI光谱数据建立的SVM模型在第8天准确率最高，建模集和预测集准确率分别为83.87%和65.63%。建立的PLSDA模型在第6天准确率最高，建模集和预测集准确率分别为69.35%和62.5%。建立的ANN模型在第12天准确率最高，建模集和预测集准确率分别为75.30%和77.00%。SVM模型准确率与PLSDA模型准确率差别不大，ANN构建的种蛋胚胎性别的检测模型整体效果明显优于SVM模型和PLSDA模型。

图6b表明以种蛋胚胎中间部位提取的ROI光谱数据建立的SVM模型在第10天准确率最高，建模集和预测集判别准确率分别为90.32%和71.88%。建立的PLSDA模型在第10天准确率最高，建模集和预测集判别准确率分别为88.71%和71.88%。建立的ANN模型同样在第10天准确率最高，建模集和预测集判别准确率分别为75.00% 和80.00%。SVM模型准确率与PLSDA模型准确率差别不大，ANN构建的种蛋胚胎性别的检测模型整体效果明显优于SVM模型和PLSDA模型。

图6　不同ROI区域构建的SVM、PLSDA、ANN模型判别准确率Fig.6 Gender detection accuracybased on SVM, PLSDA and ANN modelsby different ROI regions

图6c中可以发现以种蛋胚胎尖头部位提取的ROI光谱数据建立的SVM模型在第10天准确率最高，建模集和预测集准确率分别为69.35%和62.5%。建立的PLSDA模型同样在第10天准确率最高，建模集和预测集准确率分别为69.35%和65.63%。建立的ANN模型在第2天准确率最高，建模集和预测集准确率分别为79.70%和73.30%。SVM模型准确率与PLSDA模型准确率差别不大，ANN构建的种蛋胚胎性别的检测模型效果明显优于SVM模型和PLSDA模型。

因此，从上述结果可以发现，种蛋胚胎中间部位性别鉴定准确率优于圆头部位和尖头部位，而且孵化到第10天胚胎的性别更容易区分。原因可能是胚胎发育到第10天时，发育的睾丸和卵巢形态上差别已经比较大了，雄激素睾酮等性激素的分泌也有了较大差异[9]，也会造成雌雄胚胎光谱的差异。而选择中间部位减少了种蛋尺寸、光照等因素对光谱的影响。通过对数据的比较分析发现，以种蛋孵化第10天中间部位提取的ROI光谱数据建立模型对种蛋胚胎性别进行预测的准确率最高。鉴别结果如表1所示。

表1　基于孵化10 d种蛋中间部位400～1000 nm响应光谱对种蛋性别鉴定模型判别结果Table 1 Gender detection resultsby using spectral response of 400～1000 nm inmiddle part of hatching egg on day 10 during incubation

为了进一步分析雌雄胚胎在孵化第10天中间部位的光谱差异，提高性别鉴定的准确率，需要对光谱的响应差异做重点分析。图7为第10天所有种蛋孵化雌雄胚胎中间部分的ROI光谱平均值。可以看出，在400～600 nm和 900～1 000 nm范围内雌雄胚胎光谱响应差异很小，属于干扰信息，对雌雄胚胎的性别鉴定无法提供帮助。而在600～900 nm范围内，二者有较明显的差异，雄性胚胎的透射光谱值低于雌性种蛋，存在一定规律，有助于雌雄胚胎的性别。利用600～900 nm范围内光谱响应值构建性别鉴定模型，结果如表2所示。其中，SVM模型参数为：核函数均为径向基函数，最优参数gamma值均为0.031 6，cost值均为为100。构建的神经网络模型参数为：输入层为207，隐藏层数为1，隐藏层节点数为14，隐藏层激活函数为双曲正切；输出层个数为2，即雄性与雌性，输出层激活函数Softmax。SVM模型和PLSDA模型预测集判别准确率均从71.88%上升到75.00%，准确率提高了3.12%。ANN模型预测集判别准确率从80.00%上升到82.86%，准确率提高了2.86%，证明去除干扰信息对模型准确率的提高有一定效果。种蛋发育不同阶段，存在着不同光谱和形态的特征。种蛋中间部位处于两者之间，更靠近胚胎发育位置，随着孵化时间的延长透光性逐渐下降，光谱数据变化趋势更加稳定，因此更适合种蛋性别鉴定。

表2　孵化第10天雌雄胚胎中间区域600～900 nm响应光谱的种蛋性别鉴定模型判别结果Table 2 Gender detection resultsbased on spectral region of 600～900 nm of hatching egg on day 10

图7　第10天雌雄种蛋中间区域平均光谱曲线Fig.7 10th day average spectral curvesof male and female eggs （Middle part of egg）

3　结论

1）本文根据种蛋孵化特性，构建了种蛋胚胎性别鉴定的高光谱采集系统，确定了系统采集参数和方法，采用不同孵化时间和种蛋胚胎不同部位光谱数据，构建基于偏最小二乘判别分析（PLSDA）、支持向量机（SVM）和人工神经网络（ANN）的雌雄胚胎性别鉴定的模型，根据判别准确率的差异，确定了在孵化胚胎第10天中间部位的光谱信息最适合用于胚胎性别的鉴定。

2）根据第10天雌雄胚胎中间部位的平均光谱曲线差异，选取600～900 nm波段光谱数据重新建立性别鉴定的SVM、PLSDA和ANN模型，通过模型准确率比较，发现ANN模型准确率最高，建模集和预测集准确率分别为88.14%和82.86%，且比全波段构建的模型准确率提高2.86%。

3）本文的研究表明，高光谱图像对种蛋性别的鉴定有一定的效果。但是种蛋形状、蛋壳厚度、胚胎发育变化和放置方向等问题都会对透射光谱值造成一定影响，降低了种蛋孵化性别鉴定的准确率。在以后的研究中，需要使用更多的样本数量，选择不同的处理方法，尽可能消除个体差异对光谱数据的影响；进一步明确种蛋各个发育阶段雌雄胚胎的理化和生化差异，选择更为准确的高光谱参数提高鉴定的精度。

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Gender determination of early chicken hatching eggs embryos by hyperspectral imaging

Pan Leiqing1, Zhang Wei2, Yu minli3, Sun Ye1, Gu Xinzhe1,Ma Long1, Li Zijun1, Hu Pengcheng1, Tu Kang1※
（1.Collegeof Food Scienceand Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing210095,China;2.Schoolof Food Science,Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211171, China; 3.College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China）

Abstract:In poultry breeding, chicken gender is closely related to its productivity.For the rapid and nondestructive detection on the gender of chicken embryos in early period during the whole hatching, a laboratory hyperspectral imaging system was setup to capture hyperspectral transmission images of 94 hatching eggs on days 2, 4, 6, 8, 10 and 12, at the spectral region of 400～1 000 nm.On the 16th day during the hatching, chicken egg embryos were broken for gender determination by human visual inspection from three trained experts, due to the fact that the difference in morphology between male and female chicken embryos is enough to be identified by human vision on day 16.After comparisons among the images information between male and female embryos, no clear differences was found.Therefore, the spectral information was further analyzed.The regions of interest（ROIs）were selected at big head, middle part and small head of egg for spectral response extraction.For the optimal time and location selection for gender determination, three models including linear algorithm（partial least squares discriminant analysis, PLSDA）and nonlinear algorithm（support vector machine, SVM; artificial neural network, ANN）were built by using full band spectral response, and the discrimination accuracy for male and female embryos were compared at different time and locations based on different models.The results showed that all of the discrimination models had the best accuracy on the 10th day of incubation as well as the ROI located on the middle of egg.Next, the average spectral response difference between male and female embryos was analyzed.600～900 nm was determined by removal of bands of 400～599 nm and 901～1 000 nm, which had little difference between male and female embryos, to build the gender discrimination models based on SVM, PLSDA and ANN.The results showed that the accuracy of SVM and PLSDA were both 75.00% for prediction, which were better than the accuracy with 71.88% for both SVM and PLSDA, based on full band spectral response on day 10 and middle part.For ANN, the prediction accuracy was 82.86%, by an increase of 2.86% compared with full band spectral response.Furthermore, the overall prediction performance of ANN model had better results for gender detection than SVM and PLSDA.The results in the study showed that hyperspectral imaging technology has the potential to identify the gender of early hatching chicken eggs embryos, but the accuracy of identification may be affected by the individual differences of hatching egg.So, in further research, more samples, physicochemical and biochemical differences between male and female embryos in various developmental stages were suggested to be incorporated for higher accuracy acquision of gender discrimination.

Keywords:spectrum analysis; imaging processing; nondestructive examination; hyperspectral image; hatching egg; early incubation; embryos; gender determination

通信作者：※屠康，男，江苏南京，教授，博士生导师，博士。主要研究农产品贮藏与加工和农产品无损检测。南京南京农业大学食品科技学院，210095。Email：kangtu@njau.edu.cn

作者简介：潘磊庆，男，湖北郧县，副教授，博士。主要从事农产品无损检测研究。南京南京农业大学食品科技学院，210095。Email：pan_leiqing@njau.edu.cn

基金项目：国家科技支撑项目（2012BAD28B01，2015BAD19B03）；中央高校基本科研业务费专项（KYLH201504）

收稿日期：2015-09-08

修订日期：2015-11-23

中图分类号：S123

文献标志码：A

文章编号：1002-6819（2016）-01-0181-06

doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.01.025