孙吉浩

（宁波市北仑区疾病预防与控制中心，浙江宁波315000）

PCR技术在食源性微生物检测中的应用与发展研究

孙吉浩

（宁波市北仑区疾病预防与控制中心，浙江宁波315000）

食源性微生物检测技术在引入聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术后得以迅速发展，经历了常规PCR检测技术、多重PCR检测技术、荧光定量PCR检测技术等3个变化阶段。本文基于PCR技术的发展阶段和现状，阐述常规PCR检测技术、多重PCR检测技术、荧光定量PCR检测技术3种检测技术的原理，并对3种PCR技术在食源性微生物检测中的应用进行详细分析，提出将PCR技术应用于食源性微生物检测存在的问题及展望。

PCR技术；食源性微生物检测；应用；发展

食品安全事关生命健康和社会稳定。维护食品安全，对食品安全进行有效快速的监测是检疫机构的重要责任和主要工作。食源性致病微生物是导致食品安全风险的一个主要来源，对于食源性致病微生物的控制近年来日益受到关注。食源性致病微生物的检测方法一直在革新推进，传统的检测方法存在周期冗长、繁琐复杂的缺点，近年来发展起来的新技术克服了这些缺点，具有快速、简洁等优点，因此受到专家学者的青睐。

食源性微生物检测技术在引入PCR技术后得以迅速发展，经历了以下的变更过程：常规PCR检测技术、多重PCR检测技术、荧光定量PCR检测技术等3个变化阶段，每一阶段的技术革新都产生了实质性的突破[1]。本文基于PCR技术的发展阶段和现状，阐述常规PCR检测技术、多重PCR检测技术、荧光定量PCR检测技术3种检测技术的原理，对3种PCR技术在食源性微生物检测中的应用进行详细分析，最后提出将PCR技术应用于食源性微生物检测存在的问题，并对其进行展望。

1 PCR技术在食源性微生物检测中的应用

1.1 PCR技术的原理与发展综述

PCR检测技术根据发展情况主要可以分为三类：常规PCR检测、多重PCR检测、荧光定量PCR检测。3种检测技术的原理存在一定差异，应用时所用到的特点也各不一样，导致PCR检测技术的应用性能具有一定的差异化。下面将结合3种检测技术各自的原理对其予以解析。

1.1.1 常规PCR检测技术

常规PCR检测又称为传统PCR检测技术，其主要原理是：以热稳定DNA聚合酶作为催化剂，以引物、DNA模板、dNTP、适当缓冲液与MgCl2溶液作为反应混合物，对1对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增[2]。常规PCR检测技术可以衍生出多重PCR技术及荧光定量PCR检测技术。

1.1.2 多重PCR检测技术

多重PCR的检测原理与传统PCR基本类似，其区别在于：如果存在与各引物对特异性互补的模板，只不过是在同一反应体系中加入1对以上的特异性引物，那么就可以同时在同一个反应管中扩增出1条以上的目的DNA片段。使用这一方法可以同时检测1个以上目的基因或者借助其交叉限制进行确认。

多重PCR检测技术的特点包括高效性、系统性、经济简便性[3]。多重PCR检测技术执行快速，具有完备的检疫系统，花费成本低，操作简易，可以作为食源性微生物检测较为理想的检测技术。

1.1.3 荧光定量PCR检测技术

荧光定量PCR是近年来发展起来的一项新技术。荧光定量的主要原理是利用传统多聚酶链式反应仪应用荧光能量传递技术，通过某种化学相互作用（主要是受体发色团之间偶极-偶极相互作用）来产生效果。靶序列初始浓度从检测PCR的过程得知，能量从供体发色团转移到受体发色团，受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA产量成正比，从而达到定量目的。相较于常规PCR检测技术、多重PCR检测技术，荧光定量PCR检测技术的化学原理有了一定程度的创新和改进。

荧光定量PCR检测技术通过电脑软件实现实时在线检测PCR扩增过程，进而得到最终检测结果，而无需再次检测扩增产物，从而避免了污染。因此，荧光定量PCR检测技术具有环保、特异性好、灵敏度高等优点。另外，荧光定量PCR检测技术还可以实现“一管多检”。这些不可替代的优点和性能使得荧光定量PCR检测技术在食源性微生物检测中具有举足轻重的地位，并成为具有创新性的一种检测手段。

1.2 PCR技术在食源性微生物检测中的应用分析

PCR技术在食源性微生物的检测中具有重要的作用，随着PCR技术的不断发展和创新，食源性微生物的检测也不断取得新的进展，常规PCR检测、多重PCR检测、荧光定量PCR检测3种检测技术在食源性微生物的检测中具有不同的作用和功能。现将结合3种技术的原理分别介绍其应用。

1.2.1 常规PCR检测技术在食源性微生物检测中的应用

PCR技术最早被应用于分子生物学研究与医学诊断领域，并发挥了重要作用。20世纪80年代中期开始，PCR技术被逐渐应用于食品微生物的研究与检测。PCR技术的出现，实现了“在生物体外对特定核酸片段的扩增”的功能。传统的PCR反应循环包括以下3个过程：1）高温下双链DNA分子的变性；2）对人工合成的引物在特定温度下与变性的单链DNA退火；3）碱基在DNA聚合酶的作用下以靶序列为模版延伸。在经历反复循环之后，即可获得呈指数增长的特定DNA序列片段拷贝。特异性的扩增产物可以经由DNA荧光染料处理，通过凝胶电泳等方法进行观察。PCR检测方法中，DNA样品的准备、PCR反应、反应产物的鉴定可在前增菌后的1d内完成，而传统的微生物学检验方法大概需要消耗4～10d的检验时间，多管发酵、梯度增菌以及选择性培养基的转接等操作过程繁冗，相较之下，PCR法有着明显的快速优势。PCR反应对于特异性目的片段的扩增相比于选择性培养、单克隆挑选等方法，产生假阳性的概率降低，检测的准确性强。在灵敏度方面，大多数PCR体系对于食源性微生物的检出限可以达到10～104CFU/mL，而传统微生物学的检出限约为104CFU/mL。多方面的优点使PCR技术迅速被诸多的食源性微生物研究所采用，到20世纪90年代中期，包括空肠弯曲杆菌、大肠菌群、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌属等多种常见食源性微生物的PCR检测方法已得到初步建立和发表。在研究应用过程中，PCR检测的一些缺点和局限性也得以体现并受到关注。一方面，PCR产物中的阳性结果是通过扩增条带的大小来判断，而引物设计的缺陷有可能会导致非特异性条带的产生，对结果判断产生干扰甚至产生假阳性结果；另一方面，食品中存在的某些成分如钙、镁离子螯合剂、DNA酶或DNA聚合酶抑制物等可能对PCR反应产生抑制作用，使检测结果呈现假阴性。此外，普通PCR技术本身无法区分食源性微生物是否为活体。

1.2.2 多重PCR检测技术在食源性微生物检测中的应用

近年来，许多与致病相关的基因在对食品病原细菌致病机理的研究中被陆续发现，这些基因绝大部分都是该菌所特有的。根据这些特异性的基因设计合适的引物，扩增其高度保守区成为了应用多重PCR方法检测食品病原细菌的关键[4]。目前，在食品病原细菌检测中对于多重PCR技术的应用主要包括2个方面：单一病原细菌的检测和多种病原细菌的同时检测。

对如沙门氏菌、致病性大肠杆菌这类血清型较复杂的病原细菌，常规的单一PCR检测由于其特异性差，具有一定的局限性因而容易出现假阳性。若想提高特异性，减少假阳性，就需要再多重PCR选择目的病原细菌多个高度保守的基因序列设计引物进行扩增。

若想快速实现多种病原细菌的同时检测和分析，可以在同一PCR反应管中同时加入多种病原细菌的特异性引物进行多重PCR扩增。目前大多数病原菌对人感染剂量很低，1～10CFU的菌体细胞就足以对人致病。

1.2.3 荧光定量PCR检测技术在食源性微生物检测中的应用

传统的细菌培养法检测主要靠形态学、生化反应和血清学凝集等实验手段，检测周期长，操作繁琐，易受主观判断影响，在一定程度上会造成漏检。实时荧光定量PCR技术作为近几年兴起的一种核酸定量分子生物学检测新技术，可以弥补传统检测手段中的不足。实验研究表明，实时荧光PCR法与传统培养法相比，具有以下优点：操作便捷，节省时间，特异性强，较为灵敏。

由于PCR技术主要针对生物因子核酸片段，检测结果不能判断病原菌的死活状态，也得不到可以进行活体保存的病原体，从而无法确定检测到的核酸片段是否来源于具有生物学活性和感染力的病原菌，对于证实感染食源性致病微生物引发食源性疾病不能直接举证。因此，检验结果有时不能作为公共卫生突发事件的病原学诊断依据。鉴于上述情况，建议在实际工作中不妨将实时荧光PCR法和传统细菌培养法结合起来使用，以便优势互补。将荧光定量PCR技术应用于食源性致病微生物的检测是一种理想的检测方法，有着很好的应用前景和研究价值。

1.3 将PCR技术应用于食源性微生物检测存在的问题及展望

食源性微生物的检测仍然是一门很关键的食品安全检疫技术，对于维护人民生命健康、社会稳定具有重要的决定作用。如何利用新技术、新手段尽量消除或减少由于人为因素引起的误差，提高检验结果的准确性和客观性，同时达到良好的检测效果，依然是食源性微生物监测工作中的一个重要课题。

1.3.1 PCR技术应用于食源性微生物检测的优势

PCR检测技术目前已经在国际上获得广泛的认可，在很大程度上可消除或减少生化鉴定和血清学试验，许多步骤依靠操作者的主观判断等主观因素造成误差，并且具有节约时间、简化工作量的优点，有益于在今后致病微生物检测中使用。

1.3.2 3种检测技术各自的优劣综述

1.3.2.1 常规PCR检测技术

常规PCR检测技术的一些缺点和局限性越来越受到人们的关注。第一，PCR产物对结果判断产生干扰甚至产生假阳性结果；第二，食品中存在的某些成分可能对PCR反应产生抑制作用，使检测结果呈现假阴性；第三，普通PCR技术本身无法区分食源性微生物是否为活体，因此经过灭菌后的食品中残存的DNA物质仍有可能被扩增产生假阳性结果[5]。

1.3.2.2 多重PCR检测技术

多重PCR检测技术的特点包括高效性、系统性、经济简便性。多重PCR检测技术执行快速，具有完备的检疫系统，花费成本低，操作简易，可以作为食源性微生物检测较为理想的检测技术。多重PCR检测技术在实际应用中也存在不少问题，污染问题就是其中之一。一旦有极少量外源性DNA污染,就可能出现假阳性结果；多对引物同时扩增，各种实验条件控制不当，很容易导致扩增失败或非特异性产物；引物的设计及靶序列的选择不当等都可能降低其灵敏度和特异性。

1.3.2.3 荧光定量PCR检测技术

多重PCR检测技术在对食品样品进行检测时，增菌培养基选择不当易使有的细菌生长缓慢或被抑制，导致假阴性的结果。荧光定量PCR检测技术可以避免以上问题的产生，荧光定量PCR检测技术具有环保、特异性好、灵敏度高等优点。另外，荧光定量PCR检测技术还可以实现“一管多检”[6]。这些不可替代的优点和性能使得荧光定量PCR检测技术在食源性微生物检测中具有举足轻重的地位，而成为具有创新性的一种检测手段。

1.3.3 PCR检测技术的发展新方向

PCR检测技术今后的发展方向主要集中在以下几个方面：1）不断增加反应体系中引物对的数量，提高一次扩增反应所能检测的范围；2）优化反应条件，提高扩增效率；3）研究筛选能同时富集多种病原细菌的培养基；4）与其他技术结合，如荧光PCR、反转录PCR，提高检测敏感性和特异性，缩短检测时间。

2 结语

食品安全事关生命健康和社会稳定，维护食品安全，对食品安全进行有效快速的监测是检疫机构的重要责任和主要工作。食源性致病微生物是导致食品安全风险的一个主要来源，对于食源性致病微生物的控制近年来日益受到关注。食源性微生物检测技术在引入PCR技术后得以迅速发展，经历了以下的变更过程：常规PCR检测技术、多重PCR检测技术、荧光定量PCR检测技术等3个变化阶段，每一阶段的技术革新都产生了实质性的突破。本文的研究和展望基于当前食源性微生物的检测技术现状，希望可以对PCR技术应用于食源性微生物的情况具有一定的借鉴和参考价值。

[1]方平.PCR技术在食源性致病微生物快速检测中的应用[J].中国食品工业,2006,21(11):44-46.

[2]张然,董海强,张廷文.食源性微生物PCR检测技术研究进展及标准化讨论[J].山东轻工业学院学报(自然科学版),2010,24(4):8-12.

[3]杨卫军,张小军,张坤朋,等.PCR技术在食品微生物检测中的应用[J].安阳工学院学报,2008,7(4):16-18.

[4]胡金强,雷俊婷,詹丽娟,等.免疫学技术在食源性微生物检测中的应用综述[J].郑州轻工业学院学报(自然科学版),2014,15(3):7-11.

[5]邓紫筠.多重PCR检测技术在食品微生物检测中的应用[J].生物技术世界,2013,7(1):69-70.

[6]左慧彬.食源性致病微生物PCR检测策略的建立和优化[D].济南:山东大学,2015.

Application and Development of PCR in the Detection of Food-borne Microorganism

Sun Ji-hao
(Ningbo Beilun District Center for Disease Control and Prevention, Zhejiang Ningbo 315000)

Foodborne microbial detection technology develop rapidly after the introduction of PCR technology, through the following change process: the three stages of change conventional PCR detection technology, multiplex PCR, quantitative PCR technology, every stage of the technology innovations have had a substantial breakthrough. Based on the development stage of PCR technology and the status quo, this paper described conventional PCR detection technology, the principle of multiplex PCR, quantitative PCR technique three detection technology, the three PCR technique in the detection of food-borne microbes were detailed analyzed, the problems and prospects of PCR technology for detecting the presence of food-borne microbes were putted forward.

PCR technique; Foodborne microbial detection; Applications; Development

TS207.5

A

2096-0387（2016）02-0056-03

孙吉浩（1987-），男，浙江宁波人，助理工程师，研究方向：PCR技术。