王伟杰

(洛阳市吉利区动物疫病预防控制中心,河南洛阳 471012)

基因芯片技术在动物疫病诊断中的应用

王伟杰

(洛阳市吉利区动物疫病预防控制中心,河南洛阳 471012)

基因芯片技术是20世纪90年代发展起来的一门高新技术,具有高通量、灵敏度高,特异性好等特点。它是通过微阵列技术,将高密度DNA片段阵列,通过点样或原位合成法的形式,以一定的顺序或者排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面,借助碱基互补杂交原理,进行大量病原基因表达系谱分析、检测、基因分型等。本文简要介绍了基因芯片技术在动物疫病诊断中的应用及其发展前景。

基因芯片;动物疫病;诊断

1 基因芯片技术概述

基因芯片，又称DNA 芯片，属于生物芯片中的一种，是综合微电子学、物理学、化学及生物学等高新技术，把大量DNA 探针或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成的致密、有序的DNA 分子点阵，因固相载体常用硅玻片或硅芯片，故称之为基因芯片。基因芯片技术的基本原理是分子生物学中的核酸分子原位杂交技术：将短链核酸分子固定在固相载体上作为探针，待分析样品经过标记后与固定在芯片上的探针杂交。基因芯片技术的分类方法很多，最常用的是按载体上所点探针的长度分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片。根据芯片的功能可以分为基因表达谱芯片和DNA测序芯片；根据载体也可分为液相芯片、固相芯片。无论哪种芯片，其技术流程主要包括芯片的制备、待测样本的制备和标记、杂交反应、结果检测和数据处理分析等。与传统的核酸印迹杂交技术相比，基因芯片具有可信度高、信息量大、操作简单、重复性强以及可以反复利用等诸多优点。

2 基因芯片技术在动物疫病诊断中的应用

2.1 基因芯片技术在猪疫病诊断中的应用

猪传染病中，多种病原体混合感染极其常见，检测其病原微生物就显得尤为重要。张焕容等制备伪狂犬病病毒、猪细小病毒和流行性乙型脑炎病毒检测基因芯片。选定靶基因最佳点样质量浓度为200 mg/L，用基因芯片点样仪将其点制在氨基化基片上。结果表明，探针最佳使用质量浓度为3 000 µg/L，芯片系统检测灵敏度可3µg/L。姜永厚等建立一种可同时检测区分猪瘟病毒，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪圆环病毒2型的核苷酸基因芯片方法，针对每种病毒设计了4-6条寡核苷酸探针。利用建立的寡核苷酸基因芯片方法对76个仔猪样本进行了检测，其中25个样本（32.9%）同时感染了2种以上病毒。符芳等用猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型的特异cDNA片段作为探针制备的cDNA微阵列芯片，可以用微量病猪全血一次同时快速、准确地对上述5种病毒进行特异性检测，展示了基因芯片技术在动物疾病诊断与防制上有着极高的应用价值。杨若松等建立猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型及猪细小病毒的基因芯片检测方法，该方法对临床150份样品的检测结果显示，CSFV阳性样品有25份．高致病性PRRSV阳性样品有45份，PCV-2阳性样品有70份，PPV的检测结果全部为阴性，其中混合感染样品有18份。结果表明该法具有良好的特异性、敏感性和重复性。肖国生等利用胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌的7个从3种病菌基因组中扩增出不同特异性靶DNA制作基因芯片．并对芯片的靶DNA和探针浓度、杂交温度、重复性、特异性和灵敏度进行了研究。试验结果证明，其所研制的基因芯片特异性强、灵敏度高能检测到10～50 pg基组DNA，且芯片可重复利用，是一种能有效用于胸膜肺炎放线杆菌、猪多杀性巴氏杆菌和猪肺炎支原体鉴定和联合检测的新工具。

2.2 基因芯片技术在禽病诊断中的应用

基因芯片技术也应用于禽的一些常见传染病的诊断上。田丽娜等将克隆和鉴定的AIV的HA、NA、M、NS、NP基因以及NDV、IBDV 、IBV的保守基因片段作为探针，同时以克隆的GAPDH基因作为阳性对照，利用芯片点样系统SpotArray-TM24将探针与阳性对照、阴性对照和空白对照按照设计好的阵列点在基片上，制备了AIV等RNA病毒芯片，该方法对20份已鉴定的H5N1亚型禽流感病毒的检出率为100%（20/20）；10份送检的疑似AIV样品的检出率为70%（7/10），检测结果与RT-PCR和鸡胚传代分离鉴定的符合率为100%。结果表明，制备的DNA芯片可有效诊断禽流感等病毒。韩雪清等根据Genbank上已发表的禽流感病毒不同亚型的基因序列，设计合成了25 对特异性引物和1对通用引物，然后以各亚型病毒的参考株RNA作为模板，建立扩增不同亚型的多重RTPCR方法。参考各亚型病毒靶cDNAs区域的保守序列设计了52条亚型特异 的探针。在此基础 上，将设计好的探针点制到处理好的玻片上，制备了禽流感病毒分型鉴定基因芯片，结合所建立的扩增不同亚型的多重RT-PCR方法，开发了禽流感病毒亚型鉴定基因芯片试剂。利用收集自49个地区的2653份标本对其特异性和敏感性进行了初步评价。证明该病毒分型基因芯片具有良好的特异性、敏感性。

3 结论及展望

随着芯片技术研究的不断深入，它在医学、分子生物学领域应用越来越广泛，受到人们的普遍重视，已呈现出广阔的应用前景和商业前景。目前，人医已有10余个应用芯片技术开发的检测试剂盒被政府批准使用。随着基因芯片技术不断发展完善，它将会成为一种更快速、准确和简便的动物传染病诊断方法。在不久的将来，基因芯片技术将为动物传染病的诊断提供一个重要的研究和应用平台。

[1] 叶芬，蔡家利.基因芯片技术在猪病毒性疾病诊断中的应用[J].动物医学进展，2010，（7）：87-89．

[2] 张焕容，曹三杰，文心田，等.伪狂犬病病毒、猪细小病毒和流行性乙型脑炎病毒检测基因芯片的制备[J].中国兽医学报，2007，27（5）：667-670.