李 莹

(伊春区畜牧兽医站,黑龙江伊春 153000)

兔巴氏杆菌病的血清学诊断及预防措施

李 莹

(伊春区畜牧兽医站,黑龙江伊春 153000)

兔巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的多症状的疾病,如鼻炎、中耳炎、结膜炎、肺炎、皮下脓肿、败血症,以及子宫脓肿和睾丸炎等。确诊需进行实验室诊断。本文介绍兔巴氏杆菌病的血清学诊断法。

兔;预防;巴氏杆菌病

1 流行病学

兔巴氏杆菌病按血清型分为7：A、5：A，家兔中较易感染发病。本病无季节性，但以春秋冷热交替、气温骤变，或闷热、潮湿的雨季发生较多。当饲养管理不佳、营养不全、饲料突变、过度疲劳、长途运输、寄生虫感染以及寒冷、闷热、潮湿、拥挤、圈舍通风不良、阴雨绵绵等，使兔子抵抗力降低时，病菌易乘机入侵体内，发生内源感染。病兔的粪便、分泌物含有毒力的病菌，一旦污染饲料、饮水、用具和外界环境，通过吸血昆虫等媒介和皮肤、粘膜的伤口都可以感染发病。此病是引起9周龄～6月龄兔死亡的一种最主要的传染病，潜伏期一般数小时至5d或更长。兔巴氏杆菌能引起兔全身多处发病，为了能更好的进行判定，可以采取多种试验方法进行诊断。

2 免疫扩散试验

（1）荚膜抗原的制备：将Carter A型兔多杀性巴氏杆菌菌种移植于加有0.1%绵羊血色素的马丁琼脂扁瓶中，37℃培养16～24h后，用灭菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗下菌苔，收集于离心管中，置56℃水浴30min，6000～8000r/min离心20min，吸取上清液，定量分装，-18～-25℃冰箱保存。

（2）荚膜阳性血清的制备将荚膜抗原与油佐剂混合乳化后免疫家兔，以后再通过耳静脉注射荚膜抗原加强免疫3次即成。免疫扩散用阳性对照血清系人工感染多杀性巴氏杆菌发病耐过兔血清，经免疫扩散血清学检验为阳性。

（3）免疫扩散试验取0.7～1g琼脂糖放入含有1/10000硫柳汞的100ml0.01mol/LpH8.6 Tris缓冲液（氯化钠5.84g、三羟甲基氨基甲烷1.21g、乙二胺四乙酸0.29g，加蒸馏水至1000ml）中，热水浴彻底融化并混匀。将直径90mm平皿放在水平台上，每皿倒入热融化的琼脂糖Tris液15ml，厚度约为2～3mm。注意不要产生气泡，凝固后加盖，把平皿倒置，防止水分蒸发。按梅花形在琼脂板上打孔，中央孔径为4mm，周围孔径为3mm，孔距为4mm。在中央孔加抗原，周围孔加被检血清，扩散板放湿室，室温下进行反应，逐日观察记录结果，3d后判定。抗原孔与被检血清孔之间形成一条致密沉淀线及其末端向毗邻的被检血清孔之抗原孔方向偏弯者均判为阳性。本抗原有群特异性，采用本法诊断兔巴氏杆菌病与细菌分离的符合率在95%以上。

3 间接ELISA

应用间接ELISA诊断自然感染兔，检出率可达96.2%。

（1）抗原制备同上“荚膜抗原的制备”部分。

（2）快诊板制备 ①用pH9.6，0.1mol/升碳酸盐缓冲液将抗原稀释成最适浓度，加入到聚苯乙烯塑料反应板的各孔中，每孔加入0.1ml，加盖，4℃冰箱过夜。②次日，甩净各孔内包被抗原液，并注入pH7.2，0.01mol/LPBST（含0.05%吐温-20的PBS）缓冲液，浸泡3～5min后甩干，如此重复3次。③甩干后，4℃冰箱保存备用。

（3）操作步骤 ①将被检血清、阳性对照血清用PBST作1：200稀释，每孔加入0.1ml，每份样品加2孔，加盖，置37℃湿盒1.5h。②甩净各孔内包被抗原液，并注入pH7.2，0.01mol/LPBST（含0.05%吐温-20的PBS）缓冲液，浸泡3～5min后甩干，重复3次。③甩干后加入稀释成工作浓度的酶标记抗体，每孔0.1ml，置37℃湿盒1.5h。④同上法冲洗后每孔加入0.1ml新配制的底物溶液（0.2mol/磷酸氢二钠25.7ml、0.1mol/L柠檬酸24.3ml，加蒸馏水至50ml，即为pH5.0的底物缓冲液或柠檬酸-磷酸盐缓冲液；取柠檬酸-磷酸盐缓冲液50ml，溶解20mg邻苯二胺，临用前加入30%双氧水75µl，此液配制完成后必须立即使用），室温下反应15min。⑤每孔加入1mol/L硫酸0.05ml中止反应，用492nm波长测定每孔的OD值。

（4）结果判定凡被检血清的OD值≥0.2者判为阳性。

4 凝集试验

（1）诊断抗原将标准的A、B、C、D、E 5型兔多杀性巴氏杆菌菌株移植于加有0.1%绵羊血色素的马丁琼脂扁瓶中，37℃培养16～24h后，用灭菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗下菌苔，收集于离心管中，置56℃水浴30min，6000～8000转/min离心20min，吸取上清液即为荚膜抗原。取2ml荚膜抗原加入50%的绵羊红细胞0.2ml，37℃感作30min，其间振摇数次，离心后去上清液，用生理盐水洗涤2次后加10ml生理盐水即成1%致敏红细胞，作为诊断抗原。

（2）试管凝集试验将待检兔血清作成不同的稀释度，分别加入等量的诊断抗原，摇匀后置于37℃水浴作用1h后观察。凝集价在1：40以上者判为阳性。

（3）平板凝集试验取被检血清100µl加于载玻片上，随后加入等量的诊断抗原，轻轻摇动使诊断抗原与被检血清均匀混合，3min内判定结果。凡3min内出现絮状物，液体透明者判为阳性。

5 免疫荧光试验

用于病原的检查，即应用荧光抗体检查家兔鼻腔擦拭物的涂片，有较好的应用效果。

6 预防措施

发病后立即隔离、封锁，重病兔捕杀并深埋或焚烧，做无害化处理。症状较轻或流鼻涕、咳嗽的病兔应及时隔离治疗，慢性病兔要淘汰。兔舍用10～20%石灰乳或2～3%烧碱液定期进行消毒。坚持自繁自养。引进种兔先要进行防疫检查，并隔离饲养一个月，细菌学检查健康者方可入场。要注意日常的饲养管护，杜绝一切畜禽出入，控制传染源。

预防时可用兔巴氏杆菌氢氧化铝菌苗或禽巴氏杆菌菌苗兔疫注射，或用兔瘟、兔巴氏杆菌二联苗免疫注射。每年两次。

治疗可用链霉素2～4万单位/kg，肌注，每日2次，连用3～5日；配合青霉素2～4万单位/kg，联合使用，效果更好。磺胺嘧啶片0.05～0.2g/kg，配合等量的小苏打片服用，每日2次。氯霉素针剂60～100mg/kg，片剂按每只兔0.1 ～0.15g，每日2次，有良好的效果。对有明显呼吸症状的病兔，可用氯霉素等抗菌药物滴鼻，每次3～4滴，每日2次，有显著疗效。

[1] 陈奕营.兔巴氏杆菌病的诊断和防治[J].中国畜禽种业，2010，6（9）：117-118.

李莹（1975—），女，大专学历，助理兽医师，主要从事动物检疫工作。