朱晓敏

(朝阳市兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁朝阳 122000)

物种鉴别方法研究进展

朱晓敏

(朝阳市兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁朝阳 122000)

在动植物检验检疫事业、法医物证鉴定、物种系统发育、疾病诊断等研究中，不明来源的生物检材的种属鉴定是一个重要的鉴定环节，传统的物种鉴别方法依赖于形态学方法、解剖学方法及化学分析法，但由于环境因素的影响以及生物发育不同阶段的差异，这些方法显示出了局限性，为了克服这些缺点，许多基于基因分型的分子鉴别手段相继问世，本文对近年来应用于物种鉴别的形态学方法、免疫学方法、分子生物学方法、高效液相色谱法、近红外光谱法(NIRS)等研究方法作以综述。

物种鉴别；形态学；免疫学；分子生物学；高效液相；近红外光谱

目前，物种鉴别是我国重点研究的专项之一，物种范围广泛，从微观细菌到宏观的自然界，保护物种资源，不破坏生态环境，是研究的主要目的，但随着经济的发展，自然受到了巨大的破坏，物种在进化过程中也发生了巨大的、惊人的变化，研究物种鉴别的方法，在疾病诊断、物种分类学、流行病学、医疗及社会经济领域都将发挥重要作用。

传统的物种鉴别方法依赖于形态学方法、解剖学方法及化学分析法，但由于环境因素的影响以及个体发育不同阶段的差异，这些方法显示出了局限性，为了克服这些缺点，许多基于基因分型的分子鉴别手段相继问世，本文对近年来应用于物种鉴别的研究方法作以综述。

1 形态学方法

形态学方法最早用于种属鉴定，如根据红细胞有无细胞核，可以区分人类与鸟类。应用较多的是根据人类与其他动物的毛发、骨骼在大体形态和显微镜下结构差异，达到种属鉴定的目的。

对于饲料中动物源性成分的鉴别，运用显微镜法可对备检样品进行结构和形态学观察，低倍镜下沉淀物的结构和颜色是鉴别肉骨粉来源的第一信号，如哺乳动物的骨碎片呈白色或淡黄色，而禽类的颜色发暗且尖锐，高倍镜下哺乳动物骨碎片椭圆，禽类的骨碎片尖锐等。运用显微镜法鉴别物种，具有样品制备量少，设备便宜、简单易行等优点，但此方法费时费力，对技术人员的要求高，结果与实验员的经验相关性很大。

目前，计算机在运算速度和存储容量方面迅猛发展，使其在物种鉴别与鉴定方面发挥作用成为可能。国外自20世纪50年代起就开始运用计算机技术进行昆虫模式识别方面的探索，Yu等（Yu D.S.，1992）使用半自动的图像分析技术对姬蜂翅脉进行了测量，并成功区分5个种，成功率达到了100%.中国农业大学沈佐锐教授指导IPMist实验室利用计算机模式识别手段进行昆虫种类鉴定，利用数字图像技术对昆虫图像分割进行了较全面的研究，利用神经网络对昆虫进行自动鉴别在昆虫形态自动测量与种类自动鉴定方面取得了一系列进展。

2 免疫学方法

血清学方法是种属鉴定的经典方法，根据不同物种蛋白间理化性质差异，通过检测检样中是否有种属特异性蛋白质来达到种属鉴定的目的，包括：沉淀反应，凝集反应，酶免疫分析，等电聚焦，高效液相色谱技术及纤维蛋白溶解实验等其中环状沉淀反应方法简便，是目前常规检验方法之一。

3 分子生物学方法

无论是法医现场检材还是食品药品监督和海关打击走私的生物检材，种属鉴定的对象很多是微量甚至是混合性检材，因此常需采用分子生物学技术进行种属鉴定。用于物种鉴别的分子生物学方法主要包括限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态DNA（RAPD）、PCR特异性鉴定等。

4 高效液相色谱法

许多病原菌其致病性差异很大，但这些细菌其他特性及遗传基因都非常相似，变性高效液相色谱法（DHPLC）技术通过利用通用PCR引物扩增细菌的165核糖体RNA基因中的高度变异序列的片段，将这些来自不同种类或菌株的具有细微差异的DNA序列的细菌的扩增产物与参考菌株的扩增产物混合后进行DHPLC检测，根据所产生的独特的色谱峰图，可以作为细菌种类的分子指纹，从而可以从菌株水平鉴别病原菌。刘朝晖等运用变性高效液相色谱（DHPLC）技术对从肺炎克雷伯氏菌临床分离株产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的TEM型质粒PCR扩增的编码序列进行分析，48.6%的样本表现为异常洗脱峰，经测序、NCBI网站比对及文献检索，确定了一种TEM型质粒的新基因亚型TEM-116，为国内首次报道。

5 近红外光谱法（NlRS）

在植物药的种类鉴定方面，红外光谱已有广泛应用，具有制样简单，实验快速，谱图特征显著和重现性较好等特点。万定荣等对10种卷柏属药用植物样品的红外光谱比较研究证实，利用光谱图中的整体峰形及吸收峰的数目、位置（Cm-1），强度与峰强比率等特征，尤其是指纹区（1250-400 cm-1）的上述特征，可对各个种进行有效的辅助鉴别，还可用于药用植物或植物药材不同产地、生境样品的鉴别分析，比较近缘种间的亲缘程度。

目前NIRS已在肉类食品鉴别中开始应用，可以定量分析食品真伪，但仅有少数的研究报道利用NIRS肉类品种的鉴别，研究主要集中在区分牛肉、鸡肉、羔羊肉和牛肉的混合，以及对于牛肉、猪肉和鸡肉间的区分。NIRS主要利用样品的光学特性，利用反射，能见度或纤维光学特性区分肌肉的种类，是一种快速、有效预测不同动物品种肉类组分的方法。

综上所述，运用各种技术手段进行物种的鉴别与鉴定，在法医学实践和打击走私动物的活动中将发挥重要作用，同时，建立有效的物种鉴别方法，为防止疯牛病、禽流感等重大疫病的发生与传播具有非常重要的意义，通过物种鉴别揭示动植物自然居群、品种中遗传结构的基因流动与演变等系统发育与亲缘关系的真实本质，对于保护地方动植物物种资源，鉴别珍稀动植物物种，珍稀动植物资源的开发与利用，促进动物养殖业的发展等也将发挥重要作用。

[1] 李帅英，吴增志，李保会.物种多样性研究进展[J].河北林果研究，2002，17（1）：72-79.