苏世伟,郭顺堂,*,张 超,张 婷,梁 明

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;2.无限极(中国)有限公司,广东广州 510665)



食源性生物活性肽指纹图谱的含义与构建

苏世伟1,郭顺堂1,*,张 超2,张 婷2,梁 明2

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;2.无限极(中国)有限公司,广东广州 510665)

食源性生物活性肽具有显著的生理功能,成为世界范围内研究和开发的热点。随着生物活性肽产品的增多,建立针对特定种类肽的鉴定方法日益重要。本文在已有的关于食源性生物活性肽的研究基础上,借鉴中药的指纹图谱技术,对建立用于鉴别生物活性肽的指纹图谱的含义和构建方法进行了探讨。肽指纹图谱的建立可为肽产品行业的生产管理和真伪鉴定工作提参考。

食源性肽,生物活性,指纹图谱

生物活性肽是指具有特殊生理活性的、可影响生物体机能和健康状况的肽类物质[1],而食源性生物活性肽是指食物蛋白经水解后形成的寡肽、多肽及具有复杂线性、环形结构肽类的总称[2],如酪蛋白磷酸肽、大豆抗氧化肽、乳源降血压肽等。其中酶解法安全性高、工艺简单、成本低,适于肽产品的大量生产[3]。近年来,国内外学者对生物活性肽的种类、结构、性质及制备方法进行了深入的研究,包括具有免疫调节、增强骨密度、降血压、降血脂、抗氧化、改善肠道菌群等功能的肽类[4]。目前,已有多种生物活性肽产品上市,如核桃多肽饮料[5]、大豆多肽运动饮料[6]、鸡皮胶原蛋白肽[7]等。

然而,随着生物活性肽市场需求量的增加,肽产品的真伪和功能效果成为消费者关注的问题。但是,肽产品是由多种肽段组成的非均一性混合物,其生理活性受肽段的分子量、氨基酸组成、聚合结构等多因素影响[8],因此,仅根据肽的一种性质或特征难以对不同种类、功能或不同厂家生产的生物活性肽做出鉴别。

指纹图谱技术是借助于现代分析技术手段对某一产品中能够显示其品种、产地及组成体系特征的稳定性成分进行分析和评价的一种综合性鉴别方法,能够鉴别产品真实性和评价质量一致性[9],例如,中药指纹图谱学可鉴别中药种类、原料、物质作用基础[10];葡萄酒指纹图谱可用于鉴别葡萄酒的品种、产地、酒龄等[11]。

本文借鉴中药和酒类指纹图谱的概念和技术,结合生物活性肽的自身特点,对生物活性肽指纹图谱的含义和构建方法进行了探讨,其目的是为肽生产行业表征肽产品的功能和质量,进行生产管理和开展鉴伪工作提供参考。

1 生物活性肽指纹图谱的含义

蛋白质组学中的肽指纹图谱技术是指蛋白质被酶解或化学降解后肽段的分离分析技术[12],主要用于确定蛋白质的序列、鉴定蛋白质及分析蛋白质的完整性和准确性[12-14]。

与蛋白质的肽指纹图谱不同,生物活性肽虽然也是蛋白质水解物,但生物活性肽的指纹图谱不仅要包含蛋白质组学中的肽序列等内容,还应包括生理活性特征、基本性质,这样才能鉴别肽产品的真实性、评价质量一致性和产品稳定性。基于生物活性肽的组成、性质、结构和功能的复杂性,需借助于化学分析、光谱和色谱等多种技术进行分析,获得肽的物理化学和生物活性指纹特征。由于肽的生物活性与分子量分布、氨基酸组成、疏水性等多项因素决定[8],因此肽指纹图谱需综合多个方面的指标,包括原料特征、分子量分布、氨基酸组成、理化性质、二级结构特征、功能活性等,从而可较充分地反映出生物活性肽混合体系的整体状况,实现对生物活性肽的原料区分、品质保证和工艺监测。

2 生物活性肽指纹图谱的构建

2.1 构建生物活性肽指纹图谱要遵从的原则

2.1.1 原料要求 构建生物活性肽指纹图谱的目的是用于成分复杂、有效成分多样的肽产品活性鉴别,保证产品批次间质量的稳定性,所以要求厂家必须固定原料的品种、产地、采收季节、贮藏条件和生产工艺。

2.1.2 检测指标要求 生物活性肽的成分复杂,不仅有大量的分子量不同、性质各异的肽段,还有一些氨基酸、酚类、有机酸类萜类、生物碱类等成分。例如,Cudennec等[15]从褐虾蛋白水解物中得到的促进缩胆囊素释放的活性肽组分(1000 u

另外,一种肽段或肽类混合物可能有多种生物活性,如Meisel等[19]从牛奶蛋白水解物得到的六肽(TTMPLW)既有ACE抑制效果又有增强免疫力的作用;Srinivas等[20]酶解α-酪蛋白得到的肽类混合物同时有抗氧化、螯合Zn2+和抗菌的功效。同时,肽在贮存过程中会发生聚集[21],其性质也可能继而发生变化。肽的生物活性也受生产工艺的控制,例如由于不同的蛋白酶有不同的酶切位点[22],因而会得到不同的肽段;通过不同的离子亲和层析技术可得到具有不同金属亲和能力的肽段[23]。总之,生物活性肽的性质不稳定性及其活性受工艺影响的特定也决定了生物活性肽指纹图谱的建立必须整合多个具有专属性、重复性和可行性的指标。从复杂的数据中最大限度的提取信息,利于进一步揭示物质的隐含性质[24]。

2.1.3 检测部门要求 生物活性肽指纹图谱的应用与研究不能局限于研究与质检部门,而应与生产、流通等部门相互协调,共同参与,才可保证图谱的专属性、重复性及实用性,使得生物活性肽指纹图谱真正成为其质量评价的一种有效方法。

2.1.4 检测方法和条件要求 指纹图谱的实验方法和条件的确定是研究检测方法过程中最重要、最关键的内容,不论选择何种技术,均应结合实际,选择的原则必须具有良好的重现性和可行性。

2.2 生物活性肽指纹图谱的构建

生物活性肽的类型和功能活性由两方面决定——蛋白原料和生产工艺[25]。因此,为了全面了解一种生物活性肽,便于日后的真伪鉴别工作,需对肽的蛋白原料、生产工艺和生物活性3个方面进行研究,即建立的生物活性肽指纹图谱需包括3个层次的“子指纹图谱”:判别肽原料蛋白的指纹图谱、肽生产工艺指纹图谱、肽生物活性指纹图谱。

2.2.1 “判别肽原料蛋白的指纹图谱”的构建 食源性生物活性肽的原料来源广泛,包括植物蛋白、动物蛋白、动植物副产物等,不同原料蛋白的成本、性质、氨基酸组成和序列不同。生物活性肽是存在于蛋白质中的特殊片段,与其原料蛋白的氨基酸组成和序列密切相关。活性肽在酶解后被释放出来,显示不同的功能活性[18,26-27]。因此,固定的蛋白原料是保证肽产品质量的前提,当确定了制备生物活性肽的原料蛋白后,其种类则被进一步确认,有利于下一步的分析和鉴别,所以要建立肽原料蛋白区分指纹图谱。

肽原料蛋白区分指纹图谱的建立可通过分析特征性次生代谢产物、特征气味和HPLC-MS2测序追溯原料蛋白三种途径实现。一些蛋白尤其是植物蛋白含有特殊的次生代谢产物,如菜籽蛋白中有菜籽碱,花生蛋白中含有白藜芦醇,核桃蛋白中有酚类物质、大豆蛋白中有异黄酮等。由这些蛋白制备的肽也可能含有相应的特征次生代谢产物,因此对于这类生物活性肽,可根据通过其本身带有的特征性次生代谢产物进行区分。一些蛋白可能结合有特殊风味,如牛血清白蛋白会结合有醛类、酮类等风味物质[28],这些物质在蛋白酶解中被释放而可被检测;而一些蛋白在酶解过程中可能生成特征性风味物质,例如小麦蛋白在酶解过程中发生美拉德反应而产生肉味[29]。因此,可以通过气相色谱根据气味特征对生物活性肽区分以明确其原料来源。若无特殊的标志性物质,则可通过HPLC-MS2测序追溯原料蛋白。

2.2.2 “肽生产工艺指纹图谱”的构建 蛋白原料特征和生产工艺共同决定肽的类型和活性[30],所以当原料蛋白确定后,肽的性质(如分子量分布、两亲性、疏水性、肽含量、氨基酸组成、电荷性质等)和活性主要由生产工艺决定。生产工艺包括多个指标,如酶制剂的种类、酶用量、温度、pH等。除此之外,还有为提高目标活性肽含量的纯化或富集工艺,如Holder等[31]利用超滤系统相结合的多步循环膜反应器得到了ACE抑制能力提高13%的肽段组分;刘静等[32]利用3种酶(碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶)协同水解大豆蛋白制得相对分子质量主要集中在6000 u以下的大豆肽;Berot等[33]利用ZrO2载体膜技术分离得到疏水性肽段比例占77%～88%的肽段组分和亲水性肽段比例为84%～90%的肽组分。这些处理工艺将会影响最终肽产品的化学性质和生物活性。因此,需要在生产的各个环节设定相应的检测指标,如不同酶解时间点蛋白质的水解度;在纯化或富集环节,中间产品的分子量分布、亲水性-疏水性等特征;在浓缩、干燥、配制等环节,中间产品肽含量、生物活性等。

总之,需要掌控各个生产环节中相应产物的特征,利用各级中间产物的水解度、分子量分布、亲水性-疏水性、电荷性质、生物活性等指标共同构建肽生产工艺的指纹图谱,以对其工艺进行实时监测和有效追踪。

2.2.3 “肽生物活性指纹图谱”的构建 生物活性肽的功能活性最终由其氨基酸组成、序列和构型决定,若指纹图谱能包含这3项指标,即对每批样品的氨基酸组成、序列和构型进行定性和定量分析,则可明确地对这种生物活性肽进行防伪和质量控制。但此目的的实现需要两个条件:单一的肽段组成,明确的结构-功能关系。然而,酶解得到的肽是一种混合物,它的功能活性无法和某一特征肽段建立专一的对应性,而可能是多个肽段共同作用的结果;再者,到目前为止,肽的结构-功能关系还没有具体明确。因此,不可能将一个或几个肽段的氨基酸组成或序列测定指标作为肽的指纹。

尽管肽的结构-活性关系没有完全明确,但对一些肽的性质与功能活性的关系总结表明:肽的功能活性由分子结构、氨基酸组成、氨基酸序列决定,因此生物活性肽的结构-活性关系可由肽的化学性质与功能活性关系体现。目前所报道的肽的化学性质一般包括疏水性、两亲性、电荷性、分子量、微量元素结合能力等[34-37]。其中分子量是较重要的特征指标,如Meisel等[38]报道生物活性肽一般有2～20个氨基酸组成,Zeng等[39]发现牡蛎的水解物中,分子量在1～5 ku的范围内的肽组分生物活性最强;Cudennec等[15]发现从虾头蛋白水解物中得到的分子量在1～1.5 ku的肽段组分可显著影响缩胆素的释放;Li等[16]报道分子量在500～1500 u的玉米肽段抗氧化活性更强。氨基酸组成和疏水性也是常用指标,如You[40]和Liu等[41]报道,富含组氨酸、亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸的肽有较强的清除DPPH自由基的能力;富含疏水氨基酸(如脯氨酸和羟脯氨酸)则能有效地抑制脂肪氧化,此类肽表现出较强的疏水性;富含带正电荷的疏水区域的肽能更好地穿过细胞膜,因而有较强的抗菌功效[42];二级结构不同的肽,如α螺旋肽、β折叠肽和无定形肽的抗菌效果也有区别[43]。

由上可知,肽的生物活性主要与分子量、疏水性和二级结构有关,且这些特征性指标能通过高效液相色谱技术和红外技术获得,由此,肽生物活性指纹图谱的建立应该主要分为6个步骤:

第一，通过凝胶色谱技术分离得到不同分子量分布的肽段组分;

第二，检测各个组分的生物活性,得到单位质量生物活性最高的肽段组分;

第三，获得凝胶色谱分离前总样品和各个组分的分子量分布、疏水性、二级结构等特征;

第四，对照各个组分和总样品的分子量谱图、疏水性谱图和红外谱图;

第五，得到总样品和活性最高组分间共有的特有信息;

第六，汇总这些特有信息,构建能反应肽产品活性的指纹图谱。

总之,以众多的肽化学性质与功能活性关系理论为基础,在明确一种肽的功能活性后,可利用与肽的生物活性相关的性质指标构建肽生物活性指纹图谱。

2.3 生物活性肽指纹图谱的校对、复核和最终确立

建立指纹图谱的实验方法和实验条件必须经过严格的方法学验证,即准确性(数据间的相近程度)、精密度(数据的离散程度)、耐用性(不同条件下分析同一样品所得结果的变化程度)。因此,方法验证的目的是证明采用的指纹图谱测定方法具有可靠性和可重复性,符合指纹图谱测定的要求。

3 总结

随着生物活性肽产品种类的增多,建立肽的指纹图谱日益重要。通过肽指纹图谱,能够鉴别肽产品的蛋白来源、监控其生产工艺、保证其生理活性。利于增加消费者对产品的可信度,维护企业形象,促进肽产品行业的长足发展。

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Signification and identification of food -derived bioactive peptides fingerprint

SU Shi-wei1,GUO Shun-tang1,*,ZHANG Chao2,ZHANG Ting2,LIANG Ming2

(1.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China;2.Infinitus(China)Company Ltd.;Guangzhou 510665,China)

Food-derived bioactive peptides exert multiple biological functions and thus attract worldwide interests for research and application. The increasing prosperity of bioactive peptides products urges an accurate method for evaluation and determination of peptides products. Based on numerous researches of bioactive peptides in the passing decades,the definition and construction of fingerprint used for identifying bioactive peptides are discussed in the report. The fingerprint construction of bioactive peptides could serve as a theoretical reference for the production management and application in peptides food industry.

food-derived peptides;bioactive activities;fingerprint

2016-04-25

苏世伟(1991-)，女，硕士，研究方向：生物活性肽指纹图谱的构建，E-mail:shiwei_su@yahoo.com。

*通讯作者:郭顺堂(1962-)，男，博士，教授，主要从事植物蛋白和肽的研究，E-mail:shuntang@cau.edu.cn。

TS207.7

A

1002-0306(2016)23-0396-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.066