张建华

（乌兰察布市动物疫病预防控制中心，内蒙古乌兰察布 012000）

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的克隆表达及其单克隆抗体的制备方法

张建华

（乌兰察布市动物疫病预防控制中心，内蒙古乌兰察布 012000）

研制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的克隆表达及其特异性单克隆抗体（Mabs）的制备方法。本研究以HPPRRSV为研究对象，参照已发表的PRRSV基因组序列，设计一对PCR引物，并在其上下游分别添加BamHI和SalI酶切位点，获得的PCR产物用BamHI和SalI酶切后与经同样处理的pET-28a原核表达载体质粒连接，转化DH5a感受态细胞后挑取阳性克隆，经酶切鉴定和测序验证后，转化至 E.coli BL21（DE3）中，经IPTG于37℃诱导表达不同时间点后，取细菌菌体用SDS-PAGE分析。结果表明，Nsp2在大肠杆菌中得到表达。经包涵体的提取，用猪抗PRRSV血清抗体进行Western-bolt鉴定，结果表明，融合表达的pET28adNsp2蛋白能被PRRSV阳性血清特异性识别。取纯化的pET28a-Nsp2蛋白按每只100μg的剂量与等量弗氏完全佐剂进行乳化，并作为免疫原采取常规皮下多点注射免疫6-8周龄BALB/c小鼠。取其脾细胞与SP2/0的骨髓瘤细胞融合，经间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选，采用有限稀释法进行克隆。经过3次克隆后获得了一株抗PRRSV-Nsp2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为A2F1。Western-blot和间接免疫荧光结果显示这株单克隆抗体株能与Nsp2蛋白和PRRSV JXA1株发生特异性反应，而不与PRRSV CH1A株发生反应，证明获得的McAb为针对PRRSV JXA1株的McAb。抗体亚类鉴定结果表明，重链为IgG1型，轻链为κ链。采用间接ELISA法测得单抗的细胞培养上清抗体效价为1：800，腹水效价分别为1：12800。这株单抗的获得为进一步研究pET28a-Nsp2基因的功能及建立准确快速PRRSV的诊断方法提供了强有力的手段。

猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1株；Nsp2；单克隆抗体

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是1987年在美国首先爆发，由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种新发性传染病，主要导致母猪繁殖障碍、仔猪的大量死亡，是当前严重危害世界养猪业的病毒性传染病之一[1]。自2006年开始，高致病性猪繁殖与呼吸综合征（highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HPPRRS）在我国的暴发与流行给养猪业带来了巨大的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）属于尼多病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属成员，为不分节段的单股正链RNA病毒；其基因组全长约为15 kb，含9个开放式阅读框（ORFs），其中ORF2-7编码6种结构蛋白，ORF1编码的聚合蛋白酶产生12个非结构蛋白（Nsp1-Nsp12）[2]。在PRRSV的非结构蛋白中，Nsp2基因的保守性最差。但Nsp2含有多个B细胞表位，且表位集中的区域亲水性较强，具有较强的免疫原性，病毒感染后能够刺激机体产生特异性抗体[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体、菌种、毒株、血清、细胞和实验动物

pET-28a（+）原核表达载体；大肠杆菌DH5α、BL21 （DE3）；PRRSV JXA1株和CH1A株；抗PRRSV-NSP2的小鼠阳性血清；mark-145细胞、SP2/0骨髓瘤细胞；6～8周龄雌性BALB/c小鼠。

1.1.2 工具酶及主要试剂

各种限制性内切酶（Restriction endonuclease，RE）、T4 DNA连接酶、T4 DNA多聚酶、DNA Marker等工具酶。Taq DNA polymerase（PCR聚合酶）、dNTPs及DNA快速回收试剂盒。

新生小牛血清（超级）；RPMI-1640、DMEM、次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷培养基（HAT）、次黄嘌呤-胸苷培养基（HT）；弗氏完全和弗氏不完全佐剂、二甲基亚枫（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、聚乙二醇4000、HRP辣根过氧化物酶和FITC；单抗分型试剂盒；淋巴细胞分离液；羊抗鼠FITC标记荧光抗体；其他普通生化试剂。

1.2 方法

1.2.1 Nsp2基因的克隆与表达

（1）引物设计与合成

从GeneBank获得PRRSV Nsp2 蛋白的全基因序列，针对Nsp2基因片段设计一对引物，预期扩增的基因片段为2160bp，由试剂公司合成。

（2）目的片段的扩增

在PCR反应管中加入1μ LdNTPs（2.5mmol/L）、2μ L MgCl2、上下游引物

（3）原核表达质粒的构建与鉴定

BamHI和SalI双酶切Nsp2并切胶回收目的基因片段，用同样的酶切位点酶切pET28a原核表达载体并相连接。连接反应液转化到DH5a感受态细胞，在LB固体培养基（Amp+）上37 ℃培养。在转化的平皿中挑取一个单菌落接种于含相应抗生素的3 mlLB液体培养基，于37 ℃振荡培养10～12 h，用试剂盒提取质粒并进行酶切鉴定。

（4）蛋白的原核表达、提取与鉴定

将空白载体和鉴定正确的重组质粒同时分别转化BL 21 （DE3）感受态细胞，在转化的平皿中挑取一个单菌落接种于含相应抗生素的3 mlLB液体培养基，于37℃振荡培养10～12 h；4℃放置过夜。第二天，将培养物5000 r/min离心5 min，然后用新鲜LB洗涤1次后，用30 mL含相应抗生素的新鲜LB液体培养基重悬，于37 ℃振荡培养1～2 h，加IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导培养3 h、4 h、5 h、6 h。取1 ml菌液收集于EP管中，5000 r/min离心5 min，弃上清，加100μ l ddH20吹散混匀，加100μ l 2xSDS凝胶加样缓冲液，混匀后沸水浴5min，于12%的SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达在不同时间的表达。

取诱导表达3 h的细菌培养物8000 r/min离心10 min，收集细菌，用10 mM TE（pH 8.0）洗一次，除去残留培养基成分，再用buffer A重悬，冻融两次或加入适量的溶菌酶，置37℃温浴1 h后，加DTT与Triton X-100至终浓度分别达5 mM与1%，然后进行高频短时超声波处理数次，l0 sec/次（冰上操作），直到液体变为透明。后4℃，100000 r/min离心15 min，分别收集上清与沉淀，取样进行SDS-PAGE电泳，鉴定重组蛋白是以可溶形式还是以包涵体形式存在。剩余样品置-20 ℃备用。

依据SDS-PAGE结果，将重组蛋白所在的包涵体溶解于含20% SKL（十二烷基肌氨酸钠）的PBS（pH 7.2）中，室温静置30 min～2 h。用紫外分光光度计测出溶解的蛋白质浓度，用PBS稀释至1 mg/mL，装入透析袋，内加终浓度为0.2%的PEG4000与1 mM氧化型；还原型谷胱甘肽（摩尔比例为1：4）帮助变性的肽键依天然构象复性，用大于20倍体积的PBS进行4 ℃搅拌透析复性，每4 h换液一次，换液6次后收集蛋白液，过滤除菌后分装置-80℃保存。再经Western blot鉴定表达蛋白的活性。

1.2.2 动物免疫

表达蛋白用PBS缓冲液稀释到300 μ g/ml，与弗氏完全佐剂等体积充分混匀乳化，选择雌性6周龄BALB/c小鼠5只，颈背部皮下多点注射0.2 ml。第14 d时加强免疫1次（佐剂改用弗氏不完全佐剂，免疫剂量和部位同首次免疫）。在第24 d时尾静脉采血，分离血清，用间接ELISA法检测抗体水平，在第44 d时对免疫效果最好的BALB/c小鼠使用不加佐剂的表达蛋白0.2 ml尾静脉注射加强免疫一次，3 d后即可融合。

1.2.3 间接ELISA检测方法的建立

用纯化后的蛋白作为抗原包被酶标板，同时设PGEX-KG表达产物作为对照，按常规间接ELISA操作步骤，采用方阵法确定抗原最佳包被浓度，阴、阳性血清最佳稀释度及判定标准。

1.2.4 杂交瘤细胞的融合、筛选、克隆和腹水制备

取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞，按5：1的比例在PEG4000的作用下融合，将融合后的细胞低速离心后弃上清，用10 mL37 ℃预温含HAT的1640培养液重悬，加入事先加有90 ml饲养细胞悬液的100 mL盐水瓶中，混合均匀后滴加到96孔细胞培养板，每孔200μ l。置5%CO2培养箱中37 ℃培养。融合后第3～4d用含HAT1640培养液半量换液。待细胞生长到占孔底1/3时，取上清用间接ELISA试验方法进行筛选。选取PCV2-ORF2反应阳性而PGEX-KG反应阴性且细胞生长旺盛形态好的孔，用有限稀释法进行克隆。对抗体阳性孔采用有限稀释法克隆3次后，扩大培养收集上清，取约1×106杂交瘤细胞腹腔注入预先注射不完全佐剂7d 的6～8周龄BALB/c小鼠制备腹水。7～10 d后，无菌采集腹水，离心，经检测后分装，置-20℃冻存备用。阳性杂交细胞瘤扩大培养后，加入细胞冻存液保存在液氮中。

1.2.5 特异性鉴定

（1）Western-blot鉴定

PRRSV-NSP2重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，将凝胶中的重组蛋白转至硝酸纤维素膜上。以小鼠腹水为一抗，HRP羊抗鼠IgG为二抗，进行Western-blot鉴定。同时用抗PRRSV-NSP2的小鼠阳性血清作为阳性对照。

（2）间接免疫荧光试验

分别用用PRRSV J X A1、CH1A株感染24孔培养板中的MARK-145细胞，培养24 h后用300mmolD-氨基葡萄糖处理30 min，然后用PBS洗三次，再培养48 h后收获细胞弃上清，用PBS洗三次再用甲醇固定细胞，室温放置10 min，用PBS洗三次，再用10%牛血清封闭，37℃，30 min。用PBS洗三次加入小鼠腹水（1：100稀释），37℃，60 min，PBS洗三次，加入异硫氰酸荧光素（Fluorescein isocyanate，FITC）标记的羊抗鼠IgG（1：200稀释）37 ℃孵育30 min，用PBS洗三次置荧光显微镜下观察。同时设不接毒的正常细胞对照。用免疫鼠和空白鼠血清分别做为阳性和阴性对照。有绿色荧光者判为阳性，无荧光者判为阴性。

1.2.6 杂交瘤细胞株的特性鉴定

（1）单抗的亚类鉴定

依据Thermo公司产品说明书操作，采用间接ELISA法鉴定。

（2）单克隆抗体效价测定

采用间接ELISA方法测定。将单克隆抗体上清以及腹水倍比稀释后，分别以SP2/0细胞培养上清和SP2/0腹水为阴性对照，以P/ N ≥2.1时的最高稀释倍数为效价判定终点。

2 结果

2.1 Nsp2 基因的克隆与表达

原核表达质粒的鉴定结果：

图1 pet28a-nsp2的酶切鉴定结果

图5 pET28a-Nsp2表达产物的纯化

2.2 间接ELISA 方法的建立

以pET28a-Nsp2蛋白为ELISA抗原，分别与小鼠标准阳性血清和标准阴性血清进行方阵滴定，确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数。方阵滴定结果方阵滴定结果显示：血清的最佳稀释倍数为1：800，可溶性蛋白的最佳稀释度为1：800（蛋白含量为1875ng/ml）。用于单克隆抗体筛选之用的羊抗鼠IgG酶标抗体工作浓度为1：5000。

2.3 杂交瘤细胞株的建立

经纯化NSP2蛋白免疫的BABL/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0经PEG4000融合后，通过间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，获得1株阳性杂交瘤细胞。命名为A2F1，这株杂交瘤细胞经过3次亚克隆后，100%的检测孔保持了分泌抗pET28a-Nsp2蛋白抗体的能力。

2.4 单抗的特异性鉴定

2.4.1 单抗的亚型鉴定

采用抗体检测试剂盒测定McAb亚型，鉴定其抗体蛋白亚型。鉴定结果表明，重链为IgG1型，轻链为κ链。

2.4.2 单抗效价的测定

采用间接ELISA法测得单抗的细胞培养上清抗体效价为1：800，腹水效价分别为1：12800。

2.4.3 Western blot鉴定

Western blot 分析表明，A2F1单抗与pET-Nsp2 蛋白在预期位置83kDa处有特异性反应条带出现，而与pET28a 对照未见反应条带。

2.4.4 间接免疫荧光法鉴定单克隆抗体的特异性结果

A2F1可以和PRRSV（JXA1株）Marc-145细胞发生特异性反应，A2F1不能与PRRSV（CH1A株）Marc-145细胞发生特异性反应。

3 讨论

Nsp2 蛋白是一种非结构蛋白，是病毒在复制的过程中产生的一种RNA复制酶，在完整的病毒粒子中不存在，因此用PRRSV全病毒免疫小鼠不能使小鼠产生针对nsp2蛋白的抗体。首先，Nsp2是一个复合功能蛋白，具有 3C 样半胱氨酸蛋白酶活性，且这一区域具有顺式以及反式切割活性[4]。其次Nsp2 是PRRSV基因组中变异最大的一个基因，且变异主要集中在中部区域[4]。由于HPPRRSV（JXA1）nsp2 基因较大，表达整个基因组比较困难，所以王海燕等[4]，武佳斌等[5]以及Yan等[6]只是选择性的表达了免疫原性较强的一小段基因。而本实验通过截去NSP2基因 C 端跨膜区的疏水序列，在没有破坏nsp2表位序列以及不影响其免疫原性的情况下。设计引物扩增序列，利用表达效率较高的原核表达系统pET-28a，成功构建了重组质粒并进行了原核表达。用猪抗PRRSV血清抗体进行Western-bolt 鉴定，结果表明，融合表达的pET28adnsp2蛋白能被 PRRSV 阳性血清特异性识别。

在单克隆抗体制备过程中，抗原的纯度是制备特异性单克隆抗体的技术关键，用纯度低的抗原不仅给筛选针对目的抗原的单抗带来麻烦，也会影响抗体的产生[5]。在实验初期通过低温诱导可以使蛋白以可溶性方式表达，但是在过镍柱纯化的过程中蛋白的得率以及纯度都不理想只能通过提包涵体的方法提高它的纯度与得率，从而降低了非特异性的产生减少了工作量。Li[7]等将我国最新分离的 PRRSV JXA1和SY0608株与美洲标准毒株 VR2332 进行比较，发现 NSP2 基因有30aa缺失，同样与在我国流行的PRRS毒株CH1A相比也有30aa缺失，而Zhou，L[8]等发现缺失的30aa与毒株的毒力并没有太大的相关性。特异性试验表明，本试验获得的Mabs与NSP2蛋白有特异性反应，说明获得的Mab具有高度的特异性，而与标准美洲型毒株CH1A不反应，说明这这株单抗针对 JXA1株 Nsp2 基因中的非保守区域，能够区分标准美洲型毒株CH1A和目前流行的高致病性 PRRSV 强毒株，这为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒感染特异、敏感和快速的检测方法及N sp2基因的功能研究奠定了基础。

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[4] Han J，Rutherford MS，Faaberg KS，et al. The Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus nsp2 Cysteine Protease Domain Possesses both trans- and cis-Cleavage Activities[J]. Journal of Virology，2009，83（18）：9449-9463.

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[6] 武佳斌.HP-PRRSV（HuN4）截断Nsp2蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备[D].东北农业大学，2009.

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