王江浩，尤　帅，赵爱菊，高增玉，陈希勇，关中波*（.河北省农林科学院粮油作物研究所，河北省遗传育种实验室，河北　石家庄　050035；.河北省农业厅绿色食品办公室，河北石家庄　0500）



玉米单倍体的诱导加倍技术及其应用研究

王江浩1，尤帅2，赵爱菊1，高增玉1，陈希勇1，关中波1*
（1.河北省农林科学院粮油作物研究所，河北省遗传育种实验室，河北石家庄050035；2.河北省农业厅绿色食品办公室，河北石家庄050011）

摘要：孤雌生殖诱导系的单倍体育种技术在玉米育种中被广泛应用，极大地加快了育种进程。介绍了单倍体概念及其植物学形态；阐述了玉米单倍体的获得途径和加倍方法，以及育种中单倍体的筛选方法，其中人工获得单倍体的途径主要有远缘杂交、花药培养、小孢子培养、物理法诱导、化学法诱导、不定配子体诱导孤雄生殖、孤雌生殖诱导系诱导，加倍的方法主要包括单倍体的自然加倍和化学加倍，单倍体的筛选可以通过遗传标记性状、形态特征以及流式细胞仪和分子标记加以筛选；讨论了单倍体在缩短育种周期、群体改良、筛选突变体、构建基因定位群体，以及商业杂交种亲本保纯提纯方面的应用价值；分析了单倍体育种技术存在的主要问题，并对其应用前景进行了展望。

关键词：玉米；单倍体诱导；单倍体加倍；育种

玉米是世界第一大粮食作物[1]。而中国是世界第二大玉米生产国，产量和消费量均约占全球玉米产量和消费量的20%[2]。2012年我国的玉米产量和种植面积均超过水稻和小麦等其他作物，成为我国第一大粮食作物[3，4]。虽然近几年我国玉米产量增长较快，但增速依然低于国内需求增长，中国自2010年开始转变为玉米净进口国[5]。为了缓解这种压力，广大育种工作者应适应当前生产发展需要，尽快、高效地培育出适宜市场需求的玉米新品种。长期以来，常规的系谱法、回交法、复合杂交和轮回选择等技术是改良玉米种质的主要手段，且已培育了许多优良杂交种。然而，利用常规遗传改良方法选育一个优良玉米杂交种往往需要6～10 a的周期[6，7]，无法满足生产对玉米品种更新换代的要求。

近年来，以生物孤雌诱导为基础的玉米单倍体育种技术已经逐步成为玉米育种的关键技术。单倍体育种技术只需2个世代便可得到纯合DH系，不仅极大地缩短了育种周期，而且还可以实现配子的多样性选择，提高有利基因型的入选率，提升育种效率[8]。国外许多种业公司均已实现单倍体育种的规模化应用，该技术成为可与转基因技术、分子标记辅助育种技术相媲美的现代玉米育种的三大核心技术之一[9]。作者综述了玉米单倍体的诱导、加倍技术以及单倍体育种技术在育种和拓宽玉米种质基础上的应用以期为玉米单倍体育种技术更好地得到发展应用提供理论依据。

1　单倍体概念及其植物学形态

单倍体指具有配子体染色体组分的个体、组织或细胞，它们分化、生长出的植株为单倍体植株。自然界中单倍体是经过不正常受精形成的，一般发生率很低。1922年Dorothy Bergner首次发现了野生曼陀罗单倍体[10]，此后，烟草、小麦等的单倍体被相继发现[11]。玉米单倍体的发现较晚，1929年Randolph和Stadler首次发现并报道了玉米单倍体[12]。Randolph[13]首先观察到玉米品种间或自交系间杂交后代中有0.011%～0.103%的孤雌生殖单倍体，且不同杂交组合中单倍体产生的频率存在较大差异，但人工单倍体的产生经历了漫长过程。直到1947年Chase等[14，15]才将选育的优良纯合DH系用于商业杂交种，并于1951年培育出了有利用价值的DH系用于商业杂交种生产[16]。

单倍体由于染色体数目和配子体相等，所以其形态、解剖、遗传、生理特性等与亲本均有明显不同。单倍体相对于亲本植株均较矮小，根系变小，叶片狭长直立，单倍体植株叶片上单位面积气孔数目较多，而保卫细胞较小，叶绿体数目较少、颜色浅绿，单倍体的体细胞、细胞核和花粉母细胞均变小，花粉粒小而空瘪，绝大多数不能正常授粉结实。单倍体加倍获得纯合二倍体后，可快速选育优良自交系。单倍体育种技术直接利用配子体进行选择，提高了对有利基因型的遴选频率，大大缩短了自交系选育的年限。

2　人工获得玉米单倍体的方式

获得单倍体的方法主要有自然发生和人工诱导2种。其中，自然发生单倍体的几率极低，发生率一般不超过0.1%[17]。因此，要获得大量的单倍体必须依靠人工诱导方法。在玉米育种实践中人工诱导产生单倍体的方法主要有远缘杂交、花药培养、小孢子培养、孤雌生殖和单倍体诱导系诱导等。

2.1远缘杂交产生单倍体

亲缘关系较远的花粉一般很难与母体卵细胞发生受精作用，但却具有刺激卵细胞的作用，可诱发其成为单倍体或双倍体。在玉米远缘杂交过程中，可能由于双亲体细胞分裂周期不同步，导致其一亲本染色体丢失，从而引起单倍体的发生。

2.2花药培养产生单倍体

花药培养的原理是基于植物每一特化的营养细胞都具有全能性[18]。花药培养是获得单倍体的有效途径之一。玉米的花药培养比较困难，主要原因是玉米花药愈伤组织的诱导率和分化率较低，且受基因型的限制。在国内，谷光明最先通过花药培养获得单倍体，并经过一步步的摸索和完善，最终形成了完整的试验技术体系，成功通过花粉分化出完整植株[19]。国外研究者利用此方法，在快速获得纯系、提高育种效率方面也取得了较大进展[19]。1992年通过广西壮族自治区审定的玉米品种桂三1号就是由广西玉米研究所通过玉米花粉培养诱导出来的[20]，该品种推广面积超过了5 000 hm2，是世界首例利用花药培养得到的玉米杂交种。

2.3小孢子培养产生单倍体

小孢子培养也是获得单倍体的一条有效途径。1982年Licher[21]首次使用小孢子培养技术获得了油菜单倍体植株。禾本科作物小孢子培养研究起步相对较晚，首先在大麦上取得了突破[22]。Pescitelli等[23]首次报道了从玉米小孢子培养中分化出单倍体植株。玉米小孢子培养机理复杂，且受多种因素的影响，因此要促使供体植株健壮发育，须选择小孢子发育时期处于单核中晚期或双核早期的花药。小孢子需要预冷处理、暗培养以及弱光培养等过程，然后接种到适宜的再生培养基上，得到健壮再生植株，再经过驯化移栽到温室。

2.4物理法诱导单倍体

物理法诱导单倍体是指通过辐射照射未受精的子房或者胚珠，诱变受精过程，降低受精能力，使花粉刺激卵细胞分裂但不受精从而获得单倍体。使用最多的是X射线和Y射线。用辐射过的花粉授粉后，在玉米胚囊中可观察到1个精子同极核融合，第2个精子则消失，使单倍体诱导率提高[24，25]。

2.5化学法诱导单倍体

化学诱导单倍体常用的化学试剂有二甲基亚砜（DMSO）、马来酰肼（MH）、赤霉素（GA3）、萘乙酸（NAA）、聚乙二醇（PEG）、激动素、甲苯胺蓝、6-BA、秋水仙素、2，4-D等[26～28]。常用方法是花丝尚未抽出时将雌穗套袋，待花丝完全抽出后剪短花丝（留1～2 cm），再用注射器将化学试剂注射到花丝上，每个雌穗注射2 mL，最后再套上1层纸袋[29]。整个操作过程严格防止产生花粉污染，收获无破损袋果穗。化学诱导虽然简单，但在实际应用中存在许多缺点，如孤雌生殖诱导率低、孤雌生殖后代二倍体比例少、非整倍体居多、大多数孤雌生殖后代性状分离等。马来酰肼溶液浓度50 mg/kg预处理花柱后授粉，诱导单倍体率为0.7%[30]。余建华等[31]用浓度50 mg/L的MH和500 mg/L的PEG混合2%的二甲基亚砜处理抽丝5 d的花丝，诱导率达0.52%，约为对照的10倍。

2.6不定配子体诱导孤雄生殖产生单倍体

1969年Kermiele在玉米自交系W23中发现1个不定配子体突变基因（ig），能够诱导产生1%～2%的雄核发育单倍体[32]。以W23（ig）纯合体为母本，与育种材料杂交，用于单倍体的选育。但纯合体雄性不育，不能自交留种，而杂合体的后代只有1/4是纯合体，群体难以扩大，同时W23（ig）易感病、籽粒性状差、诱导率低，所以限制了其在育种中的应用。

2.7孤雌生殖诱导系诱导产生单倍体

孤雌生殖诱导系具有杂交诱导母本雌配子体形成高频单倍体的能力，是目前玉米单倍体诱导的主要方法。Stock6是世界第1个选育成功的玉米单倍体诱导系，应用广泛。以Stock6作为父本，与任何被诱导材料进行杂交，后代中均可出现1%～2%的孤雌生殖单倍体[33]。然而Stock6本身存在诸多缺陷，如花粉量很少或散粉不畅、自交结实性差、穗粒腐病严重等。因此，利用Stock6诱导单倍体的关键在于根据不同的生态环境对其进行改良。法国的SWl4、俄罗斯的Krasnodar Markers和摩尔多瓦的ZMS等都是以Stock6为基础，通过杂交改良的方法获得新诱导系，与被诱导材料杂交均可产生3.0%左右的单倍体[34]。我国对诱导系的研究起步较晚，但也取得了一些进展。中国农业大学育成了诱导率达5.8%的孤雌生殖单倍体诱导系农大高诱1号[35，36]。才卓等[37]选育的吉高诱系3号，诱导率达到了10.4%。刘治先等[38]选育的HOl-HOS，诱导率为2.44%～18.50%。利用玉米诱导系诱导单倍体操作过程容易、鉴定方法简单，是目前获得单倍体经济、有效的方法之一。

3　玉米单倍体的筛选

玉米单倍体的筛选可以首先通过遗传标记性状、形态特征加以筛选，然后通过细胞学检测加以确证。流式细胞仪和分子标记也能应用于玉米单倍体鉴定。

通常获得单倍体的最主要途径是利用孤雌生殖诱导系诱导产生单倍体，也是育种单位最常用的方法。一般诱导系都带有籽粒和植株颜色2套遗传标记性状，表现为紫色的胚乳顶端、胚芽尖；紫色叶片、叶鞘乃至植株。这些标记性状受显性基因控制，在杂交后代中显性表达。单倍体籽粒一般具有紫色粒顶、无色胚芽尖性状，可根据籽粒的标记性状逐粒挑选准单倍体籽粒。另外，单倍体植株田间表现矮小瘦弱，生长缓慢，叶片窄小上冲或直立，叶色浅绿。雌雄不协调，雄穗高度不育，因此，也可依据单倍体的田间表现作进一步筛选。

4　玉米单倍体的加倍

4.1单倍体的自然加倍

Chalyk[39]给234个单倍体玉米植株的雌穗授粉，平均结实26粒/穗，仅有8个果穗未结实。说明单倍体能否自交结实主要取决于雄穗是否恢复可育性。自然加倍率受环境和基因型的影响。在自然环境中，玉米单倍体植株自然加倍的概率为0.4%～1.2%。不同的基因型，自然加倍的频率差异较大，有的材料不发生自然加倍，有的材料自然加倍率达10%左右[32]。玉米单倍体植株一般表现为雄性不育及雌雄不协调，对于自然加倍率高的材料，依靠自身的育性恢复便可以自交结实。而对于自然加倍率低的材料，对其进行人工加倍恢复其育性后，才能在育种和研究中利用。

4.2单倍体的化学加倍方法

4.2.1浸种法浸种法是最简单的加倍方法，即用秋水仙素溶液（0.06%秋水仙素+2% DMSO）浸泡萌动的单倍体种子。先将单倍体种子用清水浸泡20～24 h，种子吸胀后，用秋水仙素溶液浸泡8～12 h，再用清水浸泡1～2 h后再播种，以减少对种子的伤害[40]。Gayen等用此方法处理单倍体种子，并将种子胚处进行切口处理的加倍效果最好，加倍率能达到18%。

4.2.2浸芽法当单倍体籽粒发芽到2 cm左右时，用刀片削掉幼芽顶端的胚芽鞘再浸泡[41]。Zabirova等在18℃、黑暗条件下用0.06%秋水仙素溶液处理胚芽鞘12 h，18℃和26℃恢复2 d，加倍率分别为28.8%（18℃）和31.5%（26℃）。Eder等[42]利用该方法处理单倍体，49.4%的单倍体产生了可育花粉，其中39.0%的单倍体能够自交，27.3%的单倍体自交后结实。

4.2.3浸根法该方法主要是用秋水仙素溶液浸泡单倍体幼苗根。将2～3叶期单倍体幼苗的根系在0.05%的秋水仙素溶液中浸泡24 h，清水冲洗处理后，移栽于生长发育条件良好的环境下。Bords等[43]用该方法处理3叶期幼苗的根尖3 h，散粉率达到了30%～60%。该方法加倍效果较好，但需要的药剂量大，成本较高。

4.2.4注射法注射法有2种处理方法：第1种为在田间用秋水仙素溶液注射6叶期单倍体的盾片节；第2种为在室内用秋水仙素溶液注射3～4叶期单倍体幼苗的生长点。Chase[44]用0.05%秋水仙素+l0%甘油的水溶液0.5 mL注射6叶期玉米幼苗的盾片节，结实率较对照提高了3倍以上。Deimling等[45]用0.125%秋水仙素溶液注射3～4叶期幼苗茎尖生长点，然后在18℃、黑暗条件下保持2 d，加倍率为27.5%。Eder等[42]用0.125%秋水仙素+0.5% DMSO混合溶液注射3～4叶期幼苗，处理后一部分单倍体种于温室，另一部分种于大田，发现种在温室的单倍体加倍率达到30.5%，种在大田的单倍体加倍率只有温室的l/3左右。这种方法的处理时期以及注射部位的选择难以把握，从而影响到加倍效果。

4.2.5除草剂加倍法虽然利用秋水仙素处理的加倍率较高，但秋水仙素是致癌物质，毒性大，而且对单倍体幼苗伤害较重。一些具有类似功能的细胞分裂抑制剂，如AMP、拿草特、氟乐灵和安磺灵等除草剂均对细胞有加倍作用，甚至对某些材料较秋水仙素的加倍效果还高[46]。拿草特以50滋mol/L浓度浸种处理24 h的加倍率最高，平均加倍率为10.5%。氟乐灵处理玉米单倍体，以80滋mol/L浓度浸种处理20 h的加倍率最好，平均加倍率为17.6%[47]。另外，除草剂对单倍体5～7片叶期的幼苗进行滴心处理，也有很好的加倍效果[48]。目前，国外已经广泛应用除草剂进行玉米单倍体加倍。利用除草剂这样的低毒加倍剂进行加倍将是今后研究的重要方向。

4.3组织培养加倍法

组织培养加倍的方法是利用细胞全能性在分化前使细胞还原成二倍体，从而达到加倍的目的。将秋水仙素、除草剂或其他试剂添加到培养基中，对花药、小孢子或单倍体愈伤组织等进行加倍处理，然后经分化得到DH植株的方法。Barnabas等[49]用0.02%和0.03%的秋水仙素处理玉米小孢子，得到了高度可育的再生植株。国外跨国种业公司已经利用此种方法大大提高了单倍体的加倍效率。组织培养加倍方法可能是迄今为止单倍体加倍效率最高的一种方法。今后要深入研究、掌握这种技术。

4.4气体加倍法

N2O也具有染色体加倍功能。在玉米6叶期，用N2O（600 kPa）处理2 d，可以显著提高单倍体植株的可育性，44%的单倍体植株能自交结实；未用N2O处理的单倍体，只有11%的单倍体植株能自发加倍[32]。

5　玉米单倍体育种技术的应用

5.1缩短育种周期，提高选择效率

传统的方法选育二环系，需要连续自交7代才能得到纯度为99.2%的自交系，耗时费力，而且周期较长。使用单倍体育种技术，只需2个世代便可以得到纯度为100%系，再经过2 a的测交组合试验，从选育自交系到育成杂交种只需4 a时间，与常规育种相比，省工省时，可以明显缩短育种周期。

由于单倍体只有一套染色体，没有等位基因，利用单倍体育种技术在自交系的选育过程中能简化基因互作，去掉超显性效应，保留有利的加性和上位效应；还可淘汰有害的、致死和半致死的隐性基因。因此，单倍体育种技术在提高目标性状选择的准确性、加快育种进程上具有不可替代的作用。

5.2群体改良

玉米单倍体育种技术还可以应用在基础群体的创建与改良上。育种中轮回选择基础群体中的某个体基因型若杂合程度很高，该个体被选择后虽然会将有利的基因带入下一轮的群体，但也连带有大量隐性的有害基因。应用常规方法必须要经过多轮的选择才能将这些隐性的有害基因淘汰掉，因此群体改良的进程非常缓慢。DH系应用于基础群体的创建和改良可以消除显性基因对隐性基因的掩盖作用，增加选择的准确性，提高轮回选择的效率。

5.3突变体的筛选

产生和利用有利突变，是培育植物新品种的有效方法。单倍体只有一套染色体，没有显隐性关系。因此，突变在早代可进行鉴定，经加倍处理，突变位点纯合，缩短了育种周期。但是到目前为止，单倍体技术在玉米突变育种中的研究与应用较少。

5.4构建基因定位群体

DH群体尽管所含的信息量相对较少，但群体中的每个DH系都是一个遗传上纯合的株系，能够无限繁殖，因此是永久性群体，可以连续使用。DH群体在各种环境下均可以进行重复试验，使用该群体收集到的数据与使用常规方法早代选单株收集的数据相比减小了环境的误差，而且DH系构建群体消除了常规法早代竞争的影响，大大提高了QTL定位的准确性。另外，利用DH群体还可快速建立不同的质量性状基因或QTL位点的近等基因系，以便对这些位点的作用机理进行深入研究。更为重要的是，构建玉米DH群体比构建重组近交系群体效率高，能节省大量人力物力。

5.5商业杂交种亲本保纯提纯

单倍体技术还可以用于亲本种子的保纯。在玉米种子生产过程中，亲本种子纯度是制种的关键因素之一，直接影响到杂交种的使用价值。亲本经过多年繁殖后常出现退化和混杂的现象，原来的优良性状会逐渐减弱或消失，严重时就失去应用价值。可以利用单倍体技术产生单倍体，经加倍形成DH系，使发生混杂或退化的亲本恢复其纯度和优良特性。

6　讨论

单倍体技术作为新的快速选育自交系的方法是现代育种的重要方法，但如何使这一方法能够有效地应用于育种实践仍有诸多问题需要考虑。

6.1诱导系的选育

孤雌生殖诱导系的选育是进行单倍体育种的先决条件。选育标记明显、诱导率高的玉米诱导材料是研究的重点方向，现在国外已经选育出带有荧光蛋白的高效诱导系，可以快速准确筛选单倍体籽粒，为进一步做幼胚的组织培养加倍奠定基础，目前国内这方面的研究鲜有报道。

6.2诱导基础材料的选择

与常规自交系的选育方法一样，通过单倍体诱导选系同样应重视基础材料的选择，该环节是单倍体育种工作成败的基础环节，决定着后续育种工作的意义。单倍体育种需要大量的单倍体，因此对诱导材料的选择具有一定的特殊性，主要应考虑诱导材料产生单倍体的能力以及选系材料的世代。有人主张在基础材料的F1进行诱导，有人主张在经过高压选择后的分离世代进行诱导，这些问题还需进一步研究。

6.3加倍方法的研究

随着新的诱导系的选育，诱导效率不断提高，单倍体加倍技术是目前单倍体育种中的最主要的技术屏障。当前单倍体加倍以人工化学加倍方法为主，主要用秋水仙素处理，加倍效果受溶液浓度、处理部位、处理时间、基因型等不同因素的影响而不同，研究结果也不尽相同[50～53］。

秋水仙素是一种剧毒物质，探寻无毒无害的化学试剂加倍是目前的研究方向。今后应主要对除草剂及组织培养加倍的方法进行重点研究，这可能也是最经济、最有效的加倍方法。

7　前景展望

单倍体育种技术是与转基因技术、分子标记辅助育种技术相媲美的现代玉米育种的三大核心技术之一，在国内的应用尚处于起始阶段。与转基因育种相比，单倍体育种不存在生物安全问题，并且育种周期短，特别适合我国当前的育种实际需要。单倍体育种技术可以应用于种质扩增和群体改良等各个可能的领域，将来可与分子育种、转基因技术等结合起来，发挥更大的作用。因此，以单倍体技术为核心，重点研究单倍体群体和DH系的应用方向，并结合杂种优势利用技术、形态改良技术、分子生物学技术，能大量、快速创制玉米新种质，为培育高产、优质、多抗、广适的玉米新品种提供资源保障。未来还需要在诱导机理、新型诱导系选育、单倍体准确快速鉴定、高效低毒加倍方法以及DH系管理上加强研究力度，最终形成一套高效的单倍体育种体系，实现玉米育种技术的变革，对促进国内育种技术进步、种质资源改良、品种选育和种子生产等做出更大的贡献。

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Study on Maize Haploid Inducing and Doubling Method and Application

WANG Jiang-hao1，YOU Shuai2，ZHAO Ai-ju1，GAO Zeng-yu1，CHEN Xi-yong1，GUAN Zhong-bo1*
（1.Institute of Cereal and Oil Crops，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Hebei Crop Hered-itary Breeding Laboratory，Shijiazhuang 050035，China；2.Green Food Office of Hebei Agriculture Department，Shijiazhuang 050011，China）

Abstract：The gynogenesis-inducer lines were used to induce maternal haploid，and this technology had been widely used in maize breeding，which accelerated the breeding process. The concept of haploid and its botanical morphology were introduced in this paper. The methods for obtaining and doubling of maize haploid and the screening method for haploid in breeding were introduced，the main way to obtain haploid included distant hybridization，anther culture，microspores culture，physical induction，chemical induction，induction of solitary male reproduction by the indefinite，induction by solitary female reproduction induction system. The doubling method mainly included natural doubling and chemical doubling of haploid. Haploid could be screened by genetic markers，morphological characteristics，flow cytometry and molecular markers. The application value of haploid in shortening breeding period，population improvement，selection of mutants，construction of genetic mapping population，and the purity of the parents of commercial hybrids was discussed. The main problems existed in haploid breeding technology were analyzed，and its application prospect was forecasted.

Key words：Maize；Doubling of maize haploid；Maize haploid inducing；Breeding

中图分类号：S513

文献标识码：A

文章编号：1008-1631（2016）01-0070-06

收稿日期：2015-06-15

基金项目：河北省科技支撑计划项目（14226305D）；河北省农林科学院特色优势项目（A2015060201）

作者简介：王江浩（1978-），男，河北定州人，助理研究员，主要从事作物育种研究。E-mail：Jhw78@163.com。

通讯作者：关中波（1970-），男，河北晋州人，研究员，主要从事农业推广与良种繁育工作。E-mail：guanzhongbo@126.com。