陈 丝，罗 勇，石玉兰，王坤波

（湖南农业大学 园艺园林学院，湖南 长沙 410128）

茶树中甲基转移酶的研究进展

陈 丝，罗 勇，石玉兰，王坤波*

（湖南农业大学 园艺园林学院，湖南 长沙 410128）

甲基转移酶普遍存在于茶树中，它与茶叶类黄酮物质及咖啡碱的形成、茶树冷驯化过程中DNA甲基化模式的变化和硒代半胱氨酸的形成有关。本文综述了茶树甲基转移酶的基因研究、原核表达和催化特性研究，为以后茶树体内的甲基化修饰提供理论依据。

茶树；甲基化转移酶；基因克隆

从原核生物到真核生物，甲基化反应广泛存在于生物有机体内，其产物也普遍存在于自然界中。甲基化反应是甲基转移酶催化的酶促反应，特定的甲基转移酶也有其特异的甲基化位点，通常以S-腺苷-甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）作为甲基的供体。近年来，茶叶中的甲基化儿茶素成分因其有显著的抗氧化、抗衰老、抗过敏等功效引起了科研工作者的关注，目前已在相关资源筛选[1-2]、基因克隆[3-4]以及生物活性评价[5-6]等方面取得了很大的研究进展。通过综述茶树中甲基转移酶相关基因的研究，有助于进一步了解茶树中甲基化物质的种类及其形成代谢机理，对进一步明晰和开发茶叶中的保健成分具有推动作用。

1 甲基转移酶的功能、分类及其特性

生物体内多种重要生理过程都涉及甲基转移酶的调控，如基因表达的抑制或关闭、DNA损伤的修复及微生物、动物、植物体内生理过程中间产物的合成与降解反应等[7]。根据底物不同甲基转移酶可分为两类，即遗传物质甲基转移酶和非遗传物质甲基转移酶。前者催化遗传物质胞嘧啶生理性的甲基化和由诱变物质导致的作为遗传物质附加体的甲基化两种过程。对于非遗传物质的甲基转移酶作用的底物非常广泛，从无机小分子到生物大分子，包括激素类、磷酸甘油酯类、类黄酮类、叶绿素以及香气物质等。根据底物的作用位点分为氧-甲基转移酶（O-MT）、碳-甲基转移酶（C-MT）、氮-甲基转移酶（N-MT）、硫-甲基转移酶（S-MT）和无机砷甲基转移酶（Cyt19）等[8]。氧-甲基转移酶是植物体内非常重要的酶类，可以将甲基供体的甲基转移到化合物的氧原子上形成甲基化产物，它不仅影响植物的生长发育，而且对植物与环境的相互作用也具有调控作用[9-10]。氮-甲基转移酶是参与咖啡碱生物合成的关键酶类，其酶活性是咖啡碱合成最重要的限制因子之一。DNA甲基转移酶催化和维持DNA的甲基化，从而调节染色质结构和基因的表达。硒代半胱氨酸甲基转移酶（SMT） 是植物硒代谢途径中的一个关键酶[11]。

1.1 O-甲基转移酶

在植物体内，氧-甲基转移酶主要调控植物次级代谢中的甲基化反应，尤其是苯丙类物质和类黄酮物质的甲基化。其中类黄酮氧-甲基转移酶在植物的代谢途径中起着非常重要的作用。氧-甲基转移酶的作用底物主要是酚类物质，将甲基转移到底物的酚羟基上形成甲基化产物。根据蛋白质的质量和二价离子对酶活的影响，将氧-甲基转移酶（OMTs）分类为咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（CCoAOMT）与咖啡酸O-甲基转移酶（COMT）。咖啡酸O-甲基转移酶可以催化咖啡酸等苯丙素类化合物以及一些类黄酮和生物碱类物质[12]。重组大肠杆菌内EGCG-O-甲基转移酶（EOMT）的诱导表达条件已经得到[13]，且 EGCG-O-甲基转移酶催化EGCG后生成不同类型的EGCG甲基化衍生物[14]，并明确了甲基化衍生物酶促合成的反应条件[15]。经层析纯化后，目前获得了纯度超过95%的重组茶树EGCG-O-甲基转移酶，纯化倍数为22.51倍，酶分子质量约为27.6 kD，最适反应温度为35℃、最适pH值为7.5；以表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作为底物，酶学动力学常数Km为0.100 mmol/L，Vmax为7.485 mg/（L·min）[16]。

1.2 N-甲基转移酶

咖啡碱是重要的风味物质及生理活性特征成分，对茶叶品质有着重要影响[17-18]，含量在1.2%～5.9%[19]。茶树中咖啡碱的生物合成途径主要是多个氮-甲基转移酶（NMT）参与甲基化而将黄嘌呤核苷转化为咖啡碱的过程，研究结果确认咖啡碱合成主要通过：黄嘌呤核苷→7-甲基黄嘌呤核苷→7-甲基黄嘌呤→ 可可碱→咖啡碱路径合成，包括 3次甲基化作用和 1 次核苷酸酶反应的过程[20]。根据催化底物及转移甲基的位置不同可将参与咖啡碱合成的氮-甲基转移酶分成 3 类：第一类为黄嘌呤核苷甲基转移酶（Xanthosine methy transferase， XMT）；第二类为7-甲基黄嘌呤甲基转移酶（7-methy xanthine methyl transferase，MXMT）；第三类为 3,7-二甲基黄嘌呤甲基转移酶（3,7-dimethyl xanthine methyl transferase ，DXMT）。Negishi等从茶树叶片中首次提取到黄嘌呤核苷甲基转移酶，其最适pH值为7.5～8.0，并且氯汞苯甲酸（PCMB）、 Zn2+及 Cu2+对其酶活性有强烈的抑制作用[21]。Waldhauser等首次从咖啡叶片中分离纯化出黄嘌呤核苷甲基转移酶，分子量约为40 kDa，酶的最适pH值为7.0[22]。Simone等通过盐析、离子交换、凝胶层析等一系列纯化过程后， 得到7-甲基黄嘌呤甲基转移酶和3,7-二甲基黄嘌呤甲基转移酶，结果显示两者具有很多相同的性质，如催化反应的最适pH值都为7.5，最适温度都为35℃，等电点都在pH 4.5～5.0之间，但在催化性能上有所区别，3-氮-甲基转移酶比1-氮-甲基转移酶容易与甲基受体结合，相反，1-氮-甲基转移酶 比3-氮-甲基转移酶更容易与甲基供体结合[23]。

1.3 DNA-甲基转移酶

DNA甲基化是在 DNA甲基转移酶的催化下完成的，甲基转移酶将S-腺苷-甲硫氨酸（SAM）的甲基基团转移到胞嘧啶的 5-位碳原子上从而完成甲基化过程[24]。非DNA序列遗传信息的传递称为表观遗传，它不涉及基因序列的改变，不符合孟德尔式的遗传方式，其中DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，是调节基因组功能的重要手段。DNA甲基转移酶能够通过改变其表达水平调节植物DNA甲基化或去甲基化的进行[25]。茶树冷驯化过程中同时发生了甲基化和去甲基化现象，但总体变化趋势表现为甲基化水平的增加[26]。研究利用甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）和高效液相色谱法（HPLC），分析了不同冷驯化阶段茶树基因组DNA甲基化水平及状态变化，表明茶树在抗寒响应中出现DNA甲基化现象[26]。

1.4 硒代半胱氨酸甲基转移酶

茶树是天然富硒能力较强的植物，茶叶中的硒80%为有机硒[27]。硒是微生物和动物必需的微量元素[28]，是至今发现最强烈也最具潜力的抗癌营养素[29]。据地质学家考证，我国 72 %的地区属于缺硒地区，2/3 的人口存在不同程度的硒摄入量不足[30]。硒代半胱氨酸甲基转移酶专一催化硒半胱氨酸甲基化为甲基硒代半胱氨酸，降低了硒代半胱氨酸和硒甲硫氨的含量，从而阻止了氨基酸错误进入耐硒物种的蛋白质中，在植物硒营养代谢过程中发挥关键作用[31-32]。

2 甲基转移酶的基因克隆及原核表达分析

2.1 O-甲基转移酶

马成英等研究获得一类茶树氧甲基转移酶基因 cDNA 全长并构建了该基因的原核表达载体[33]。研究从茶树叶片中克隆得到了一个类黄酮氧-甲基转移酶基因，成功构建了原核表达载体，并使其在大肠杆菌中得到了高效表达[34]。李小霞等以从茶树叶子中提取的总RNA为模板，结合RT-PCR利用RACE技术，得到咖啡酸氧甲基转移酶基因全长[35]。

2.2 N-甲基转移酶

谢果等提出植物中可能有多达14种的氮-甲基转移酶，而茶树的氮-甲基转移酶类也十分复杂[36]。许煜华等研究表明茶树存在着一个与嘌呤碱合成相关的氮-甲基转移酶基因家族，且多个基因的序列高度相似[37]。Mohanpuria 等利用 RNAi干扰技术抑制咖啡因合成酶（TCS）的表达，仅将茶树的咖啡碱含量降低了 44%～61%[38]。金基强等研究克隆了多个氮-甲基转移酶的基因组DNA全长，初步明确了它们的基因结构和序列差异[39]。Moisyadi等首次报道从咖啡树中克隆到催化咖啡碱合成第一步甲基化反应的黄嘌呤核苷N-甲基转移酶基因，其cDNA编码1个含有371个氨基酸的蛋白质，该蛋白没有显示出与其他甲基转移酶蛋白较高的同源性，并且通过RNA技术抑制该编码基因可以调控咖啡中咖啡碱的含量[40]。 Kato 等人从茶叶嫩叶中纯化得到咖啡碱合成酶， 并测定N端的部分氨基酸序列，利用 RACE 方法成功克隆得到N-甲基转移酶基因 TCS1，并通过体外表达和功能验证证实了TCS1为编码茶树咖啡碱合成酶的基因，它能有效催化 7- 甲基黄嘌呤生成可可碱，并催化可可碱生成咖啡碱[41]。余有本等从龙井43克隆得到氮-甲基转移酶基因，并在大肠杆菌中表达，得到的蛋白具有氮-甲基转移酶的后两步催化活性[42]。

2.3 DNA-甲基转移酶

基因表达的改变，涉及许多调控机制，其中DNA甲基化是一个调控基因功能的重要手段[43]。在低温驯化过程中某些与抗寒相关的基因发生变化从而对低温做出响应[44]，茶树通过转录组测序等技术分离出一大批与冷驯化相关的基因, 这些基因在经过冷驯化后上调或下调表达[26]。随着冷驯化的进行，茶树中DNA甲基转移酶CsDRM2基因的表达量呈现上升趋势，在脱驯化时期表达量达到最大，说明CsDRM2的表达与茶树冷驯化之间有一定关系；DNA甲基转移酶DRM2 基因的表达量逐渐增加，在冷驯化时期的表达量高于冷驯化之前，在脱驯化时期表达量达到最大，说明茶树能够通过改变CsDRM2 基因的表达水平来调节基因组 DNA 甲基化的变化[45]。

2.4 硒代半胱氨酸甲基转移酶

朱林等从富硒茶树品种中已克隆出茶树ATP硒半胱氨酸甲基转移酶基因的cDNA[46]。茶树硒代半胱氨酸甲基转移酶基因cDNA全长1368 bp，开放阅读框位于50～1105 bp处，编码产物为稳定的亲水性蛋白，无跨膜结构，无信号肽，定位于细胞质基质。二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主[47]。目前已经将硒半胱氨酸甲基转移酶基因导入根癌农杆菌中，获得转化工程菌[48]。

3 讨论与展望

近年来，成熟的生物信息学技术为茶树甲基化转移酶的研究提供新的手段和方法，甲基化反应逐渐清晰，而茶树甲基化作用酶类氧-甲基转移酶、氮-甲基转移酶、DNA甲基转移酶以及硒代半胱氨酸甲基转移酶的研究尚不够深入。

茶树中氧-甲基转移酶基因分子水平研究[34-49]以及如何提高甲基化儿茶素得率的研究报道较少，且作用机制还未清晰，限制了进一步探讨茶树中代谢产物的甲基化修饰；未来的研究应进一步阐明咖啡碱合成过程中氮-甲基转移酶等相关酶类的基因克隆及功能研究，尤其是氮-甲基转移酶在合成过程中的中间产物及调节机制并不清楚。此外，茶树DNA甲基化与抗寒之间关系的研究尚未见报道，以及还未对分离到的差异片段进行测序与功能验证。硒代半胱氨酸甲基转移酶（SMT）基因还未获得全序列，SMT全基因的生物信息学有待深入研究。总之，进一步丰富茶树甲基转移酶及甲基化修饰的理论将有助于茶树甲基化代谢产物的开发与利用。

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Research Advances in Tea Methyl Transferase

CHEN Si，LUO Yong，SHI Yu-lan，WANG Kun-bo
（Landscape and Horticulture College of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China）

Methyl transferase is commonly found in tea plant. It is associated with the biosynthesis of flavonoids and caffeine, changes of DNA methylation levels and patterns in tea plant during cold acclimation & the biosynthesis of selenocysteine. Methyl transferase genes were cloned from Camellia sinensis and their prokaryotic expression vector for genes was constructed. The catalytic specificity for flavonoids of methyl transferase has been reviewed, which provide theoretical basis for the future synthesis of methylated modification.

Tea, Methyl transferase, Gene cloning

S571.1

A

1009-525X（2016）04-03-08

2016-06-16

2016-08-10

国家自然科学基金项目（31470692）、教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-11-096)

陈丝（1992-），女，湖南衡阳人，在读硕士研究生，研究方向：茶树种质资源与生物技术。

*通讯作者：王坤波，wkboo163@163.com