■李　丹　邱　静　谷　旭　李军国　杨曙明

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所农业部农产品质量安全重点实验室，北京100081；2.中国农业科学院饲料研究所，北京100081）



不同大豆原料中单宁含量的差别分析

■李丹1邱静1谷旭2李军国2杨曙明1

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所农业部农产品质量安全重点实验室，北京100081；2.中国农业科学院饲料研究所，北京100081）

摘要：文章改进了国标测定单宁所采用的分光光度方法，以钨酸钠-磷钼酸混合溶液显色后与高效液相色谱检测相结合，在760 nm紫外波长处进行测定，实现了批量样品的自动进样分析，大大简化了样品的分析过程，方法在1～6 mg/l范围内具有良好的线性关系，而且测定实际样品的结果与分光光度法的结果一致。用该方法检测了176个大豆饲料原料样品，并依据原料加工工艺和分布地域进行分析，结果发现发酵豆粕中的单宁平均含量（5 365.0±749.0）mg/kg明显高于普通豆粕、膨化豆粕和膨化大豆，而在国内七大地域中，西南地区中大豆饲料原料中单宁的平均含量（3 758.0±1 296.6）mg/kg最高。

关键词：单宁；高效液相色谱；饲料原料；豆粕；含量

单宁又名鞣酸、单宁酸，是一种高度聚合的多羟基酚物质，分子量约为1 700～2 000，具有生物活性，广泛存在于植物的叶、茎、皮、果内，是植物资源综合利用的对象（李金凤，2010），也广泛用于化工、食品、医药和冶金等领域。单宁可分为水解单宁和缩合单宁，许多谷物籽实和油料籽实中都含有单宁，如豆类籽实、木薯、马铃薯、高粱、橡籽、草籽等，这些籽实类及加工产品都是常用的饲料原料。在饲料卫生学中单宁被视为抗营养因子，饲料中单宁含量过高会影响饲用价值，饲料中高含量单宁会影响动物的食欲，降低采食量、营养物质的消化利用率，甚至引起胃肠道疾病和毒害肝肾（李德发，2001）。大豆制品作为常用的饲料原料，经过不同工艺处理后其中单宁的含量均不相同，因此本文对比分析了普通豆粕、发酵豆粕、膨化大豆、膨化豆粕四种不同的原料中单宁的含量，同时对比了不同地域范围内大豆制品中单宁的含量，为畜禽饲料的配制加工、原料选用等提供了重要的参考和支撑。

目前国内外对单宁测定的方法主要有分光光度法、皮粉法（张辞海等，2013;中华人民共和国卫生部药典委员会，2000），干酪素法（程立方等，1995），滴定法（何照范，1982），高效液相色谱法（HPLC）（郭佳莉等，2007；何和明等，1996）等，其中分光光度法应用最为普遍，根据其显色原理不同，常用的有柠檬酸铁氨法（任建军，2006；中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，2008），钒显色法（霍权恭等，1996），钨酸钠法（中华人民共和国农业部，2008；潘娟等，2012；王勇等，2011；中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，2011），铁氰化钾法（黄春芳等，2002），高碘酸钾氧化亚甲基蓝褪色动力学法（王术皓等，2004）等。现行国家标准GB/T 27985-2011（中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，2011）采用分光光度法测定饲料中单宁的含量，但分光光度法操作相对复杂，在检测大批量样品时需要逐个手动灌装和更换比色皿，检测效率较低。本实验以GB/T 27985-2011为基础，改进了样品仪器检测方法，采用高效液相色谱实现了大批量大豆饲料原料样品的高效率测定。

1　实验方法

1.1仪器和试剂

钨酸钠(Na2O4W·2H2O)，磷钼酸(H3Mo12O40P·XH2O),无水碳酸钠（Na2CO3），磷酸为分析纯，丙酮为色谱纯，超纯水，单宁标准品。单宁酸工作液：精确称取单宁标准品，以超纯水溶解定容，配制成1 000 mg/l的单宁储备液，于4℃保存待用。精确量取10 ml单宁储备液，以水定容至200 ml，配制成50 mg/kg的标准工作液。显色剂Ⅰ：钨酸钠-磷钼酸混合溶液，精确称取100.0 g钨酸钠，20.0 g磷钼酸，溶于约750 ml水中，移入1 000 ml回流瓶中，加入50 ml磷酸，充分混匀，接冷凝管，沸水浴上加热回流2 h，冷却，移入容量瓶中以水定容至1 000 ml，摇匀，于棕色瓶中，常温下储存待用，使用期限14 d。显色剂Ⅱ：75 g/l碳酸钠水溶液，准确称取37.5 g无水碳酸钠于250 ml温水中，充分溶解混匀，冷却稀释至500 ml，于储存瓶中常温下备用，期限14 d。

高效液相色谱仪（Waters 2695），配置四元泵和二极管阵列检测器（PDA，Waters 2998），紫外检测波长为760 nm。流动相：超纯水；进样体积：10 μl；流速：1.0 ml/min。无需液相色谱柱，试样经自动进样器导入系统后随流动相直接进入检测器测定。

1.2实验操作

参照国标GB/T 27985-2011方法，准确称取样品2 g（精确至0.01 g），置于250 ml具塞三角瓶中，加入50 ml丙酮ϑ水（1ϑ1），加塞密封，振荡提取30 min，静置后，以定性滤纸过滤，收集全部滤液，充分混匀后取出1 ml，置于盛有约30 ml水的50 ml棕色容量瓶中，摇匀，加入2.5 ml显色剂Ⅰ，5 ml显色剂Ⅱ，以水定容至50 ml，摇匀后静置30 min显色。过0.22 μm水系微孔滤膜后，上HPLC检测。

2　结果与讨论

2.1HPLC流动相优化

本实验对比了纯甲醇，甲醇/水（95ϑ5，V/V），纯乙腈，乙腈/水（95ϑ5，V/V）和纯水对单宁测定的影响。结果发现，甲醇/水与乙腈/水两种流动相获得的单宁色谱峰形不对称，而使用纯甲醇和纯乙腈时，不同浓度标准品受流动相的影响，其响应却基本相似，不呈线性变化趋势。只有将纯水作为流动相的条件下，单宁才能获得理想的色谱峰形，而且浓度和峰面积之间呈现出较好的线性相关关系。

2.2标准曲线

精确移取适量单宁工作液，分别置于盛有约30 ml水的50 ml容量瓶中，摇匀，加入2.5 ml显色剂Ⅰ和5 ml显色剂Ⅱ，以水定容至50 ml，摇匀后静置30 min显色，配制成0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/l标准系列工作液。过0.22 μm水系微孔滤膜后，上HPLC检测。以单宁标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制得到标准曲线方程为y=14 053x+6 345.9，相关系数R为0.999。典型的单宁标准溶液色谱见图1，豆粕样品色谱如图2所示。

图1　单宁标准溶液（1 mg/l）液相色谱

2.3方法准确性验证

GB/T 27985-2011采用钨酸钠-磷钼酸混合溶液显色，以分光光度法检测单宁，由于分光光度法需人工对样品进行逐个清洗、检测、记录，不但需要大量的时间和精力，而且反复的冲洗、润洗造成了各种溶液的浪费，增加了环境的压力，因此不适用于大批量样品的快速检测。本实验使用高效液相色谱法替代分光光度法，以超纯水作流动相分析样品，无需色谱柱分离而直接进入PDA检测器测定，不仅实现了样品的批量自动进样，而且大幅缩短了检测时间，提高了检测效率。

图2　随机检测豆粕样品的液相色谱

由于本方法采用的是GB/T 27985-2011规定的前处理方法，该标准已经经过了严格的方法验证和评价，而本实验所做的改进仅仅是检测仪器不同，因此无需再对整个方法进行系统的方法学考察。但为了进一步验证本方法的准确性，随机抽取了一定数量的饲料原料样品，分别采用高效液相色谱法和分光光度法检测，结果（见表1）表明两者之间的相对标注偏差均低于5.81%，因此改进后的高效液相色谱法与原国标GB/T 27985-2011中的分光光度法检测结果基本一致，说明本方法准确可行。

2.4不同工艺大豆饲料原料中单宁含量的分布

本实验从国内20个省市抽取了176个大豆原料，其中包括120个普通豆粕，6个膨化豆粕，33个膨化大豆，17个发酵豆粕，其中单宁含量的基本检测情况如图3所示。

表1　高效液相色谱法和分光光度法检测结果对比

图3　不同工艺生产的大豆饲料原料的单宁含量对比

四种类型的饲料原料中单宁的含量由高到低依次为：①发酵豆粕，平均含量为（5 365.0±749.0）mg/kg，检出值在3 239.8～6 214.2 mg/kg范围内；②豆粕，平均含量为（3 49.7±501.0）mg/kg，检出值在2 010.7～ 4 966.0 mg/kg范围内；③膨化大豆，平均含量为(3 117.6±443.2) mg/kg，检出值在2 122.4～3681.6 mg/kg范围内；④膨化豆粕，平均含量为(2 896.2±335.6) mg/kg，检出值在2 317.2～3 307.2 mg/kg范围内。相对而言，发酵豆粕中单宁平均含量最高，而普通豆粕、膨化豆粕和膨化大豆的含量总体相近。发酵豆粕是利用现代生物工程发酵菌种技术与中国传统的固体发酵技术相结合，以优质豆粕为主要原料，接种微生物，经微生物的发酵而形成的豆粕。原豆粕中的大分子物质被微生物分解，大豆蛋白被降解为优质小肽蛋白源，并产生了益生菌、寡肽、谷氨酸、乳酸、维生素、UGF（未知生长因子）等活性物质，而抗营养因子单宁也会被最大程度的游离出来，以致发酵豆粕中的单宁平均含量相对其他工艺生产的饲料原料较高。

2.5不同地区大豆饲料原料中单宁含量的分布

根据国内七大区域划分，对具有明确采样地区信息的174个大豆饲料原料进行单宁含量分布分析，结果如表2所示。七大地区大豆饲料原料样品中的单宁含量高低依次为：西南地区（3 758.0±1 296.6）mg/kg，华北地区（3 510.4±982.0）mg/kg，华南地区（3 493.4± 1 000.5）mg/kg，华东地区（3 315.5±649.6）mg/kg，西北地区（3 251.3±729.3）mg/kg，东北地区（3 100.6± 444.1）mg/kg，华中地区（3 038.3±731.4）mg/kg。相比较而言，西南地区大豆饲料原料中的单宁平均含量最高，而华中地区的含量最低。

表2　不同地区大豆饲料原料中单宁含量的检测统计情况（mg/kg）

潘娟等（2012）检测了饲料中的单宁含量，结果发现大豆饼粕中单宁的平均含量为4 033.0 mg/kg，在本实验所检测样品的含量范围内。作为饲料原料的豆粕中单宁含量普遍高于禽畜配合料中单宁的含量（1 180～2 377）mg/kg，原因可能是配合料中加入了其他种类的饲料原料，对豆粕中的单宁进行了稀释，也可能是因为配合料在后期加工过程中，部分加工工艺会造成单宁含量的降低。

3　结语

本实验在GB/T 27985-2011基础上，使用高效液相色谱法替代分光光度法测定饲料原料中单宁的含量，实现了大批量样品的自动进样分析，显著缩短了仪器分析时间，使得该方法更适用于批量样品的快速检测。大豆饲料原料的检测结果表明其中含有的单宁含量普遍较高，发酵豆粕由于微生物发酵的处理，其单宁平均含量要高于其他3种饲料原料，而西南地区的含量则要高于其他六大地区。本实验的方法和结果为畜禽饲料的配制加工、原料选用、单宁含量的测定等提供了重要的参考和支撑。

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（编辑：文奇男，wenqinan@sohu.com）

Analysis of the difference of tannin content in soybean seed

Li Dan, Qiu Jing, Gu Xu, Li Junguo, Yang Shuming

Abstract：In this paper，high performance liquid chromatography（HPLC）was used to replace the spec⁃trophotometric method for the determination of tannin in feed, while tannin was colored by sodium tungstate - phosphomolybdic acid mixture and then detected at 760 nm using UV detector. This meth⁃od has a good linearity within 1～6 mg/l, and some results of real samples were consistent with those from spectrophotometric method. Then the method was successfully applied to detect 176 samples from soybean, the results showed that average content of tannin in fermented soybean meal (5 365.0± 749.0) mg/kg is significantly higher than ordinary soybean meal, expanded soybean meal and expanded soybean. While in domestic seven areas, the highest average content of tannininsoybean feed (3 758.0± 1 296.6) mg/kg is observed in the southwest area.

Key words：tannin；hplc；feed；soybean meal；content

基金项目：公益性行业(农业)科研专项经费项目[201203015]

收稿日期：2015-11-05

通讯作者：邱静，博士，研究员。

作者简介：李丹，硕士，主要从事分析化学方法的开发与研究。

中图分类号：S816.32

文献标识码：A

文章编号：1001-991X（2016）01-0038-04

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.01.008