微孔板法测定乳粉中叶酸含量的前处理方法优化

叶酸，是一类化学结构相似、生化特征相近的化合物统称，由蝶啶、对氨基苯甲酸和一个或多个谷氨酸结合而成，是维生素B复合体之一[1]。它具有促进骨髓中幼细胞成熟，改善血管内皮功能、预防心血管疾病等作用，缺乏叶酸可能引起人体巨红细胞性贫血以及白细胞减少症[2-3]。叶酸是乳粉中重要的营养物质之一，为了保障乳粉的质量安全，开展乳粉中叶酸的检验方法研究显得十分重要。

叶酸常用的检测方法有比色法[4]、薄层层析法[5]、同位素放射免疫法[6]、色谱法[7]、微生物法等[8-9]。在我国的食品标准中，微生物法是检测食品中叶酸含量的主要方法。尤其是在传统的微生物法基础上微量化和简便化发展的微孔板法备受青睐[10]。但是由于乳粉的基质比较复杂，使用微孔板法进行叶酸检验时，前处理条件对实验结果的影响显著。本文通过考察微孔板法中提取温度、提取时间和离心转速等前处理条件对实验结果的影响，寻找最优的前处理条件，以利于保证测定结果准确可靠。

仪器与试剂 仪器 电子天平（梅特勒PL2002）、酶标仪（Multiskan Mk3型）、生化培养箱（PHX-330H）、数 显 恒 温 水 浴 锅（HH-4）、pH计（Mettler Toledo FE20）、台式高速冷冻离心机（湘仪H1850R）。

试剂 包被有鼠李糖杆菌的微孔板、叶酸培养基、叶酸标准品、叶酸缓冲液、无菌水。以上试剂均来自VitaFast Folic Acid 定量检测试剂盒

磷酸盐缓冲液（0.05mol/L，pH7.2）：将7.8g磷酸二氢钠（广州化学试剂厂）加入1L去离子水中，调节pH至7.2，缓冲液需要当天制备。

实验样品 含定量叶酸的标准乳粉（中国检验检疫科学研究院测试评价中心），该乳粉标称含量为：126.0 μg/100g。

实验方法 标准曲线配制 以无菌水为稀释液，按表1方法配置标准曲线溶液。

表1 标准曲线配制方法

单因素试验方法 提取温度。准确称取1.0000g± 0.0005g样品，将其加入50mL无菌离心管中，加入30mL磷酸盐缓冲液，混匀，再用磷酸盐缓冲液补至40mL。分别在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴中提取30min，前3min每1min混匀一次，后每5min混匀一次（确保离心管密封），快速冷却至30℃以下。在10000r/min下离心15min，然后在1.2mL无菌深孔板中对上清液进一步稀释。

提取时间。准确称取1.0000g±0.0005g样品，将其加入50mL无菌离心管中，加入30mL磷酸盐缓冲液，混匀，再用磷酸盐缓冲液补至40mL。分别在100℃水浴中提取10min、20min、30min、40min、50min，前3min每1min混匀一次，后每5min混匀一次（确保离心管密封），快速冷却至30℃以下。在10000r/min下离心15min，然后在1.2mL无菌深孔板中对上清液进一步稀释。

离心转速。准确称取1.0000g±0.0005g样品，将其加入50mL无菌离心管中，加入30mL磷酸盐缓冲液，混匀，再用磷酸盐缓冲液补至40mL。在100℃水浴中提取30min，前3min每1min混匀一次，后每5min混匀一次（确保离心管密封），然后快速冷却至30℃以下。分别在 4000r/min、6000r/min、8000r/min、10000r/min、12000r/min下离心15min，然后在1.2mL无菌深孔板中对上清液进一步稀释。

检测方法 在包被有鼠李糖杆菌的微孔板中加入叶酸培养基150μL，摇晃微孔板，使包被菌充分溶解在培养基中，再加入150μL标准曲线溶液或待测样品，每样3孔，作3次平行，用粘合箔盖住微孔条，用手将粘合箔平压，使其充分封闭微孔板条，保证粘合箔和微孔的封闭性。37℃避光孵育48h。充分混匀培养物，使用酶标仪在波长为630nm下测量OD值。以3孔OD值的平均值为该样品的OD值，代入标准曲线计算得出该样品的叶酸含量。取3次平行的结果为该处理方法的最终结果。计算其与标示值的绝对差值Dx，Dx越小，表明结果越接近真值，该处理方式较合理。

结果与讨论 标准曲线 以叶酸含量为横坐标，OD值为纵坐标，采用4次多项式回归的方法，得到标准曲线如图1所示。相关系数R2=0.9981，线性关系良好。

图1 标准曲线

提取温度 在不同温度下提取叶酸30min，10000r/ min离心处理后，所得叶酸结果如表3所示。从结果可以看出，随着提取温度的升高，Dx也减小，水浴温度达到沸水浴（100℃）时，Dx最小，提示沸水浴可能是最适合的水浴条件。

表3 不同提取温度下叶酸含量结果

提取时间 在沸水浴中以不同时间提取叶酸，然后经10000r/min离心处理后，所得叶酸结果如表4所示。实验结果表明，随着提取时间的延长，Dx减小，在10min至30min间下降明显，30min后，Dx下降趋缓。说明在沸水浴，离心转速10000r/min下，水浴处理30min以上即可获得较理想的实验效果。

表4 不同提取时间下叶酸含量结果

离心转速 在100℃下水浴30min后，以不同的离心转速处理样品液，所得叶酸结果如表5所示。实验结果表明，随着离心转速的提高，Dx减小，在4000r/min到10000r/ min间降幅明显，转速超过10000r/min后，Dx基本不变，说明离心转速越高，越有利于叶酸的检测。

表5 不同离心转速下叶酸含量结果

从整体来看，无论采用哪种处理条件，用微孔板法测定乳粉中的叶酸含量，Dx均为正数，即检测结果偏高。其可能原因是微孔板法测定乳粉中叶酸含量的实质是比浊测定，利用的是叶酸作为鼠李糖杆菌生长的必需营养素，鼠李糖杆菌生长繁殖速度与叶酸含量成正相关，表现为体系的浊度与叶酸含量成正相关的关系[11]。乳粉溶液是一种复杂的胶体分散体系，无机盐在水中以溶解状态存在，蛋白质以胶体状态悬浮在溶液中，脂肪形成乳浊液分散于乳中[12]。因此乳粉溶液本身存在较强的基质干扰。消除基质干扰的主要方法是沉淀体系中的大分子尤其是蛋白质等。温度提高和离心速率的提高都有利于体系中乳蛋白的沉淀[13]。此外，叶酸溶于热水有一交换平衡过程，本实验结果表明，40mL反应体积大约需时为30min，30min后该交换基本达到平衡。离心转速的提高不仅可以进一步沉淀蛋白质等物质，还能使脂肪等成分上浮，脱离牛奶本体，使离心后的清液更接近于溶液，让培养后的OD值更直观地表现为微生物的生长情况。

前处理条件的控制对检测乳粉中叶酸含量影响显著。提取温度、时间和离心转速均对结果产生影响。其影响程度大致是离心转速>提取时间>提取温度。在沸水浴中，加热30min，离心转速为10000r/min的条件下处理，结果较理想。在该条件下，能在最大限度上减少基质干扰，使乳粉中叶酸测定结果更接近真值，提高了检测结果的准确性。

□ 广州甘蔗糖业研究所

广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室

国家糖业质量监督检验中心

刘学文 高裕锋 邓倩南 陈海宁 林雅慧

余构彬 郭剑雄 李海乔