唐恩奇，李 滨，蒋欢欢, 汪丽燕

桂林医学院附属医院消化内科，广西 桂林 541001

构造肝癌动物模型的研究进展

唐恩奇，李 滨，蒋欢欢, 汪丽燕

桂林医学院附属医院消化内科，广西 桂林 541001

肝癌模型的构造是学者研究肝癌的发病机制、临床诊断以及治疗预后的重要一步。动物模型构造的效果直接影响了对肝癌的研究进展。近年来，学者对肝癌动物模型的构造有越来越多的探索，并且取得了很大的进展。本文探讨多种肝癌动物模型的构造方法，比较各种造模方法的利弊。

肝肿瘤；动物模型；二乙基亚硝胺；黄曲霉毒素B1

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是人类最常见的肿瘤之一，病死率极高。制备良好的肝癌动物模型是人类对肝癌进行研究的重要前提条件。目前，肝癌动物模型的构造有多种方法，其中最常见的是诱发性肝癌模型，其次是移植性肝癌模型，而自发性肝癌模型因制备成功率较低及制备时间较长等因素，一般不为研究采用。

1 诱发性肝癌动物模型

诱发性动物模型主要是指运用化学、物理或生物致癌因素作用于动物，使动物自然发生肝癌。其中因化学致癌因素可控性大而通常被使用。下面介绍常用的化学物质诱癌方法。

1.1 二乙基亚硝胺(DEN)诱导肝癌模型

1.1.1 实验动物选择：应选用健康纯系大鼠，常用品种有Wistar、SD大鼠。大鼠的性别和年龄对诱癌率高低有直接关系。一般认为雄性大鼠比雌性大鼠的成功率高。选用幼年大鼠，质量控制在200～250 g。

1.1.2 给药途径：常见的给药途径有2种，分别为口服给药和注射给药。两者各有利弊，前者易受个体差异造成饮水量的差异，但操作较简单安全，可控性高。后者一般选用腹腔注射，优点是可以严格控制剂量，减少个体之间给药的计量误差，缺点是操作复杂，易因大鼠的反抗影响实验结果。

1.1.3 给药方案：(1)实验组以含DEN 80 ppm浓度饮水, 连续12周后改为自由饮水。诱癌率为70.6%[1]。(2)实验组大鼠给予DEN 100 mg/kg腹腔注射后辅以N-亚硝基吗啉80 ppm自由饮水，16周后诱癌成功[2]。(3)Solt-Farbe诱癌模型的方法[3]：实验组大鼠第1天给予一次性腹腔注射DEN 200 mg/kg，2周后喂含有0.02%的2-乙酰氨基芴(2-AAF)饲料，持续喂2周，第3周末做2/3肝切除术, 第4周末恢复标准饲料，该方法诱癌速度快,在第4周即可发现大鼠肝内出现大量变异肝细胞灶。(4)实验组大鼠每日给予30 μg/ml DEN饮用水，自由饮用22周[4]。(5)实验组大鼠前3周腹腔注射DEN 50 mg/kg， 2次/周，至第4～6周改为1次/周，停药至第11周，恢复原剂量1次/周注射至第13周，再停药，约至19周诱癌成功[5]。(6)实验组大鼠给予腹腔注射5 mg/kg，连续注射6个月[6]。(7)实验组大鼠给予DEN皮下注射，每周2次，连续注射15周。在16～24周期间停止注射恢复正常饲养。25～40周，DEN以0.05 g/L的初始剂量和0.1 g/L的最终剂量加入饮用水中自由饮用。41～50周恢复正常饮用水[7]。

用DEN诱发肝癌模型特点为诱癌成功率较高,对肝脏较专一，肝细胞癌所占比例较大，是迄今应用最广泛的一种建造肝癌模型的方法[8]。值得提出的是，由于二乙基亚硝胺是剧毒药物，在诱癌过程中，个别老鼠会因为不能耐受药物的毒性而提前死亡，所以应该注意观察老鼠的精神状态，食欲情况，有无竖毛、呼吸急促等症状。具体给药方案应该根据老鼠的综合情况而做出适当调整：减少药物剂量或者停药一段时间。不能盲目追求造模周期，应该注意保证老鼠的生存率以便进行后续研究。朱艳志等[9]在造模过程中采取了DEN间断给药方法，即在大鼠喂含0.01% DEN水期间根据大鼠的精神、饮食、粪便、毛色及活动等一般情况设立间歇期，在间歇期内喂正常水，此方法诱癌成功率高、大鼠存活率高。周倜等[10]按20 mg/kg给予DEN腹腔注射SD大鼠，3次/周，至12周时停药，此方法采用间断小剂量注射DEN，致癌率为76.2%，死亡率仅为 8%，大大降低了诱癌过程中大鼠的死亡率。

1.2 黄曲霉素(AFB1)诱发肝癌模型

1.2.1 实验动物的选择：同上述DEN诱发肝癌造模方法。

1.2.2 给药途径：多用腹腔注射、直接灌胃两种。也有少数用经口给药法。

1.2.3 给药方案：(1)实验组大鼠每日以200 μg/kg剂量AFB1灌胃至4周，诱癌率高达96%[11]。(2)有学者用AFB 10.75～1.5 g/kg一次性腹腔注射，2周后以含0.015%的2-AAF饲料饲养4周，可以建立AFB1致大鼠肝癌的短期模型[12]。(3)(4)实验组于第3周开始以200 μg/kg腹腔注射AFB1，3次/周注射至第16周；第22～30周以100 μg/kg，2次/周注射；第35～45周以 100 μg/kg注射，每周1次[13]。(5)实验组大鼠腹腔注射100～200 μg/kg，每周1～3次。诱癌率达76%[14]。

用AFB1构造肝癌模型诱癌周期较长，一般需要1年时间以上。AFB1可诱发肝癌，但不能伴有严重的肝实质损害、不能伴发肝硬化,癌变与肝小胆管增生并无明显关系;在诱癌早期主要以变异灶为主,少见结节，中期开始结节比例升高，中晚期以结节为主，晚期可见肝细胞癌和混合细胞癌[15]。

1.3 二甲基氨基偶氮苯(3′-Me-DAB)诱发肝癌模型

1.3.1 实验动物的选择：选择健康的SD雄性大鼠。

1.3.2 给药途径：经口给药。

1.3.3 给药方案：(1)用6%的3′-Me-DAB花生油溶液按2∶98比例与精制大米配成诱癌饲料进行正常饲养，实验组每天喂10 g/只，早晚2次,每次5 g，喂养3个月后停药改喂普通饲料[16]。(2)用0.06%浓度的3′-Me-DAB的饲料喂养实验组大鼠，20周后诱癌成功[17]。

诱发性肝癌模型在建造过程中可以控制诱癌剂量和诱癌条件，诱癌结果多为肝细胞癌弥漫结节型，且合并肝硬化，较为接近于人肝癌的发病过程，且发病率和发病时间易于人为控制,结果重复性好。缺点是诱发时间一般较长,动物喂养至少需要3～5个月或者更长时间。

2 移植性肝癌动物模型

移植性肝癌动物模型是指用来源于动物或人的肝癌组织或细胞移植到动物体内(肝脏、肝外组织或器官) 所形成肝癌动物模型。人类肿瘤移植瘤常来源于肿瘤活检组织、手术切除标本或人类肿瘤细胞系。目前国内常用的移植性肝癌动物模型有大鼠模型、小鼠模型及裸鼠模型。

2.1 Hep-G2细胞株建立裸鼠肝癌模型

2.1.1 实验动物的选择：多选择裸鼠。

2.1.2 实验方法：取培养的HepG2细胞,浓度为6.0×106/ml。实验组每只裸鼠在皮下注射0.2 ml细胞悬液[18]。

2.2 移植性大鼠肝癌模型

2.2.1 实验动物的选择：Wistar大鼠或SD成年雄性大鼠。

2.2.2 实验方法:(1)皮下种植：取1 ml癌细胞悬液注射于Wistar大鼠肋腹皮下。接种后6～9 d皮下即可摸到黄豆般大的瘤块，呈圆形或椭圆形，逐渐增大，晚期肿瘤平均直径3.4 cm。皮下移植常因肿瘤浅在及局限，便于观测而被采用。但此模型的缺点是具有较高的自发消退率[19]。(2)腹腔种植：可取原发灶肝癌组织制成细胞悬液，注射于Wistar大鼠腹腔内。该方法移植成功率高，但因为肿瘤的生长部位深且不局限，不便于研究。(3)肝内接种：SD大鼠随机分为实验组和对照组。SD大鼠以2%的戊巴比妥钠0.4 ml腹腔注射麻醉消毒后,剑突下沿正中线剪开腹壁2 cm后暴露肝左叶，实验组大鼠用注射器与肝表面呈约30～45°接种Walker-256细胞质;对照组则注射相同剂量的生理盐水[20]。

动物肝癌模型的建立具有多种方法，在研究过程中造模的具体方法的选择应该根据实验目的、周期等多方面的因素综合考虑。选择合适的肝癌模型不仅能为研究提供良好的研究条件还能促进实验结果的产生，是肝癌相关研究中最初始也是至关重要的一步。提高诱癌率、降低诱癌动物的死亡率将能为肝癌的临床研究提供更理想的动物模型。

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(责任编辑：王全楚)

Research progress of animal models of hepatocellular carcinoma

TANG Enqi, LI Bin, JIANG Huanhuan, WANG Liyan

Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541001, China

Establishment of hepatocellular carcinoma models is important for studies on pathogenesis, diagnosis and clinical treatment of hepatocellular carcinoma. The effect of establishing models will influence the study of hepatocellular carcinoma. Recent years, more and more scholars have discussed how to create hepatocellular carcinoma models and have made great progress.In this article, various methods of establishing models were discussed and the differences among those methods were compared.

Hepatocellular carcinoma; Animal models; Diethylnitrosamine; Aflatoxin B1

广西教育厅科研基金资助项目(2013YB155)

唐恩奇，在读硕士研究生，研究方向：信号转导通路与消化系肿瘤的发生、发展机制。E-mail: 747676379@qq.com

汪丽燕，副主任医师，硕士生导师，研究方向：信号转导通路与消化系肿瘤的发生、发展机制。E-mail: 168wangliyan@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.08.004

R735.7

A

1006-5709(2016)08-0857-03

2016-03-17