刘　静，郭红延　综述　郭希民　审校



牙周膜再生方法主要研究进展

刘静1，郭红延1综述郭希民2审校

牙周膜再生；细胞移植；细胞归巢

由于牙周炎患者自身的牙周膜干细胞(periodental ligament stem cells,PDLSCs)再生能力降低[1]，进而分化能力下降，因此增加牙周受损区域具有再生能力的细胞数量是解决问题的关键。

牙周膜对于牙移动、牙营养，以及维持牙周内环境稳态至关重要[2]其主要特点是具备快速的基础代谢和应力改变能力，尽管咀嚼压力很大，但牙周膜可使牙根与牙槽骨呈动态与紧密连接状态[3, 4]。牙周膜自身重建及允许牙齿移动的能力在维护牙周组织中起重要作用[3]。牙周膜这种维持牙周内环境稳态的机制是由于牙周膜能很好的适应压力变化，并能够维护本身宽度[5]。牙周膜的另一个重要功能是调控牙槽骨骨量和充当组织血管生成和再生的细胞储存库。当牙周组织因咀嚼和炎性反应应答受损时，牙周膜是进行骨重塑修复的未分化间充质干细胞的主要来源[6, 7]。其再生主要通过细胞募集(cell recruitment)和归巢(cell homing)来实现[8]。

1　细胞移植法

1.1牙周前体细胞或干细胞移植许多研究均证明：牙周前体细胞在体内外移植均可以重建新的牙周组织。一些学者通过体外构建牙周膜三维立体生长环境，从而实现了牙周膜的再生。20世纪90年代，Bhatnagar等[9]认为胎牛无机骨质复合胶原中分离的多肽(P-15)最能模拟牙周膜细胞分化的体内三维立体环境，细胞在其中能形成类似牙周韧带的有序纤维。随后，有文献报道称已有一个用于研究牙周膜再生的3D模型[10]。然而，它所提及的实验装置是复杂的，重建大量组织非常有限。因此，研发一种新的但相对简单的3D模型吸引了许多学者的关注。Oortgiesen等[11]通过建立新型3D模型模拟人工牙周膜空间培养牙周膜细胞,研究结果显示:在标准培养液内牙周膜细胞随机定向分布在这个人工牙周膜空间内，在机械负载下，牙周膜细胞数目较多，依靠时间和位置延伸压力，细胞垂直重组排列，结果形成大量的天然牙周膜组织。由此可见这项研究在牙周膜相关再生领域研究中成功引入了新模型。常秀梅等[12]利用可吸收生物材料冻干胶原膜和犬牙周膜干细胞在体外也成功了构建组织工程牙周膜。这些研究提示我们，模拟牙周膜空间人工构建牙周膜可能是未来研究的一个方向。

另外，牙周膜细胞或牙周膜干细胞通过体内植入也实现了牙周膜的再生。2008年Liu等[13]发表有关研究牙周膜干细胞的文章。这篇研究表明在猪模型上实现了牙周膜的再生，为牙周病的干细胞治疗奠定了基础。后来甚至Ma[14]及其同事发表了有关牙周膜再生的文章，并且证明了受DNCPs刺激的牙周膜干细胞出现牙骨质样细胞的形成。宁慧影等[15]通过构建牙本质管与牙周膜细胞膜片和煅烧骨(CBB)颗粒移植体，移植在裸鼠皮下8周后实现了牙周膜的再生。Lee[16]和Smit[17]等学者的研究也都成功获得完整的牙周再生，这为以后探索完整牙周组织的再生提供了新的策略。Lee是通过利用具有时空传递生物活性分子的多相特定区域的微支架，优化了来自牙髓干细胞或前体细胞，实现牙本质、牙骨质、牙周膜以及牙槽骨再生的环境，从而实现完整牙周复合体的再生。而Smit等学者是通过牙周前体细胞复合胶原膜包绕天然牙根原位再植来研究牙周膜再生的情况，在再植6个月后实现了具有完整新牙周膜形成的牙根的再附着。作者推测：天然牙根表面的地理形态可能对垂直型细胞的延长变形有诱导作用，这种微环境适宜牙周膜纤维再生。在未来的研究中，如果揭开了牙周前体细胞形成细长形和平行牙周附着纤维的信号因素和分化机制的神秘面纱，这样一个信息将会有利于非牙周前体细胞和干细胞应用于牙周再生。

1.2骨髓间充质干细胞移植目前，许多学者研究发现：BMMSCs移植可诱导大鼠、小型猪、兔、狗的包括牙骨质、牙周膜和牙槽骨在内的牙周组织再生[18, 19]。通过细胞标记技术，在活体内BMMSCs能够分化成牙骨质细胞、牙周膜成纤维细胞和牙槽骨成骨细胞[20-22]。Zhou及其同事[22]揭示了同种异体BMMSCs移植到放射致病裸鼠体内参与牙周愈合的可能性。Yang及同事[21]的一项研究表明：BMMSCs是很好的细胞来源，揭示了当微球凝胶载体负载BMMSCs移植到大鼠牙周缺损处时有利于牙周愈合。也有动物研究揭示，BMMSCs移植到实验制造的III类牙周缺损处促进了牙周组织的再生[23, 24]。在缺损处裸露的牙根表面，有牙骨质覆盖其表面，并有沙比纤维插入牙骨质中，获得完整的牙周再生。也有研究表明，来自于牙周膜的一种特定的体液因子影响BMMSCs的分化和增殖[25]。也有学者研究表明，BMMSCs分化成特定的细胞系依赖于它所处的环境[23, 26]。Kramer等[27]将牙周膜细胞和骨髓间充质干细胞进行共培养，结果骨髓间充质干细胞可以向牙周膜细胞的表型转化。这些研究揭示了BMMSCs可能受牙周微环境的影响，分化成牙周膜干细胞，从而参与牙周组织的再生。

2　细胞归巢法

尽管细胞移植法在牙周膜再生研究中取得一定成果，但机体内自身存在许多可供组织修复再生所需的干细胞，细胞归巢法诱导并动员这些干细胞募集或归巢至靶向部位，以期实现牙周内源性再生。Haze等[28]通过重组成釉蛋白在狗的牙周缺损模型上实现了牙周缺损区域骨和牙周膜的再生。通过免疫组织化学分析以及干细胞标记物发现，成釉蛋白直接或间接诱导招募间充质前体干细胞，随后分化形成新的牙周膜组织。但这项研究对于诱导细胞归巢的具体机制尚不清楚。然而有学者研究发现，骨髓来源细胞(Bone marrow-derived cells，BMDCs)，是一组异质性干细胞或前体细胞，包括BMMSCs、造血干细胞、成骨细胞前体细胞、成纤维细胞前体细胞和内皮细胞前体细胞[29-34]，BMDCs能够感受损伤信号并归巢至受损区域参与组织修复或再生[35-37]。因此，除了传统的细胞移植，BMDCs的归巢可能被认为是一种可选择性治疗方法。Wang等[38]学者通过建立嵌合子小鼠模型，即将小鼠的骨髓与来自表达EGFP的转染小鼠的骨髓细胞重组。骨髓移植一个月后，创造小鼠的牙周近中缺损。研究发现GFP阳性BMDCs在牙周缺损区域聚集并出现在新形成的骨或纤维中。它们中的一些共表达成纤维细胞、成骨细胞或血管内皮细胞标记物。这些研究结果表明在牙周修复期间BMDCs可能造成新纤维、骨和血管的形成。 Zhu[39]等研究通过SDF-1和BMP-7诱导细胞归巢也实现了撕脱牙回植后牙周膜样组织的再生。并且断定，撕脱牙通过目前开展的细胞归巢方法在延迟回植时能够成功避免牙与牙槽骨之间的骨性愈合或者替代性吸收。Amir和 Zhu等学者通过采用生物活性因子激发机体内源性再生潜能，从而实现了牙周膜的再生，由此可见，生物活性因子可成为诱导细胞归巢的重要工具，然而，直接应用生物活性因子可能会由于它们的流失及毒副作用而出现不理想的治疗效果。因此，研发一种生长因子控释系统可能成为机体干细胞募集和归巢调控进而实现组织再生的一个技术突破口。

细胞归巢作为实现组织内源性再生的方式，它发挥作用的途径一直备受关注。已有研究证实：有两种完全不同的途径实现机体干细胞归巢。一种是非血流依赖性运动，主要依靠邻近部位的细胞募集，比如缺损区域相邻干细胞龛中的干细胞可感应损伤产生的信号分子，通过主动的变形运动，到达组织缺损区域，发挥再生作用；另一种是血流依赖性迁徙，主要是远程机体干细胞龛(例如骨髓)中干细胞的动员和归巢，包括细胞感受信号刺激，动员机体干细胞龛中的干细胞入血，随血流远程迁徙，最后到达损伤区域局部毛细血管，穿透血管壁，参与组织修复过程[40]。

总之，尽管干细胞移植在牙周再生领域已有突破性进展，但其临床转化研究仍然面临着挑战，例如细胞移植方式、手段和剂量标准等尚未得到根本解决[41]，牙周膜的结构与功能性再生仍是目前研究的“瓶颈”。在牙周病的治疗策略上，寻求一些简单、经济且实用的再生方法可能是我们以后研究的重点。随着细胞归巢的诱导和调控机制研究的进一步推进，实现牙周内源性再生将会给牙周病治疗带来新的转机。

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(2016-04-21收稿2016-08-11修回)

(责任编辑梁秋野)

刘静，硕士研究生，医师。

1.100039北京，武警总医院口腔医学中心；2.100850北京，军事医学科学院基础医学研究所全军干细胞与再生医学重点实验室

郭红延，E-mail:ghyfmmu@126.com

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