阚旭辉，郭红英,2，谭兴和,2，李清明,2

（1.湖南农业大学食品科学与技术学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

可食性植物源抗氧化肽的研究进展

阚旭辉1，郭红英1,2，谭兴和1,2，李清明1,2

（1.湖南农业大学食品科学与技术学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

抗氧化肽是一种安全可靠的抗氧化剂，可在食品工业中广泛应用。可食性植物源抗氧化肽因具有较高的开发价值和应用前景，近年成为该研究领域的热点。综述了可食性植物源抗氧化肽的制备方法、活性评价方法、问题与展望，以期为更好的开发利用植物源抗氧化肽提供参考。

植物源；抗氧化肽；制备；评价方法

抗氧化肽是一类生物体内源性的或由生物体蛋白质水解后生成的，具有清除自由基、抑制脂质过氧化作用的活性寡肽或多肽。构成肽的氨基酸种类、数量及氨基酸的排列顺序决定着肽的抗氧化能力［1］。抗氧化肽不仅在油溶体系中有良好的增效作用，而且在水溶体系、乳化体系及干燥体系中也有较高的抗氧化活性，因而在人类健康、食品加工、医药等领域应用前景广阔［2］。在抗氧化肽的研究领域中，可食性植物源抗氧化肽由于来源广泛、安全可靠，受到国内外学者的广泛关注。笔者从可食性植物源抗氧化肽的制备方法、抗氧化活性的评价及应用等方面进行综述，以期为充分开发利用植物源抗氧化肽提供参考。

1 植物源抗氧化肽的制备

目前，可食性植物源抗氧化肽的获得途径主要有3种：第一种是利用分离提取技术从可食性植物中直接提取内源性抗氧化肽；第二种方法是通过蛋白酶酶解、发酵降解或酸解法可食性植物源中的蛋白质制备抗氧化肽；第三种方法是利用现代技术手段如重组DNA技术、酶法、化学法等针对已知的可食性植物源抗氧化肽进行合成。

1.1 直接提取法

直接提取法就是应用一些分离技术和手段，将所需的目标肽从原料中分离出来并对其进行分析和利用。许多可食性植物源中存在天然的抗氧化肽，如大豆、玉米胚、小麦胚、山黧豆、水果、海藻、山药、紫薯等均检测到谷胱甘肽（Glutathione，GSH）［3-5］。GSH是植物中最丰富的一种内源性抗氧化肽，对氧化应激和免疫功能均具有调节作用。GSH作为一种抗氧化剂，在强化食品风味的同时亦对人体有较显著的保健作用，它在食品加工业中的应用前景明显优于其他防腐剂或抗氧化剂。李丽［3］采用超声复合酶法从数种紫薯中提取GSH，得到了较好的提取效果；徐丽萍等［4］以玉米胚为原料，采用水提法对玉米胚中还原型谷胱甘肽的提取工艺进行了系统的研究，通过条件优化，可使还原型谷胱甘肽的提取率达到0.145%。

植物中内源性的抗氧化肽含量很低，若将其从植物中分离出来并获得较高纯度的产物，必须要经过多次提纯和浓缩，操作复杂且成本较高，对资源的浪费也较严重。另外，在分离提取的过程中由于用到大量化学试剂，将对环境造成污染，或导致所提取的抗氧化肽中溶残超标而带来毒性等问题，因此该法主要用于实验室进行一些功能性短肽的活性产生机理和结构鉴定等方面的研究。

1.2 蛋白质降解法1.2.1 蛋白酶酶解法 蛋白酶酶解法的重要工艺参数包括酶的种类、酶解时间、加酶量、温度、pH值等。目前，用于制备植物源抗氧化肽的生物酶制剂主要有碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶系等。蛋白酶酶解法具有条件温和、降解位点特异、快捷、可控、重复性高等优点，是目前抗氧化肽制备领域的研究热点，但仍然有很多问题亟需解决，如商业蛋白酶的价格较高、酶解过程中抗氧化钛的活力下降、酶回收困难等。

（1）碱性蛋白酶酶解法。

碱性蛋白酶主要来源于芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌。研究发现，与其他蛋白酶相比，碱性蛋白酶可催化生成更多分子量较小、耐消化性较强、抗氧化活性较高的抗氧化肽。因此，在植物源抗氧化肽的制备中应用十分广泛。Diao等［5］利用碱性蛋白酶酶解小麦胚芽粕制备抗氧化肽，确定最优试验条件为：加酶量0.8%（w/w），料水比1∶12.3，酶解时间2.1 h。此条件下得到的DPPH自由基清除率为49.78%，水解液中肽含量1.9%（w/w）。冷帅辰等［6］采用碱性蛋白酶水解长白山松子制备抗氧化肽，结果显示当松子抗氧化肽浓度为4 mg/mL时对ABTS自由基的清除率和Fe2+螯合率达到100%，16 mg/mL时对DPPH自由基清除率达到80.95%，24 mg/m L时对羟基自由基清除率达到100%。徐亚元等［7］选用碱性蛋白酶制备脱脂米糠抗氧化肽，其优化的最佳试验条件是：温度50℃、加酶量1. 8%、底物浓度5%、pH值9. 0、酶解时间276 m in；结果显示脱脂米糠抗氧化肽对ABTS自由基清除率可达71. 85%。Bamdad等［8］用碱性蛋白酶水解大麦醇溶蛋白，结果显示水解产物浓度为0.5 mg/mL时，对DPPH自由基清除率为48%～58%。Jin等［9］利用碱性蛋白酶水解玉米蛋白质，得到的玉米抗氧化肽对·OH、DPPH·、ABTS+·均具有较强的清除能力。

（2）中性蛋白酶酶解法

中性蛋白酶是在枯草芽孢杆菌的发酵液中提取得到的一种内切酶，可广泛用于水解蛋白质。李宏睿等［10］使用中性蛋白酶水解白糯米，得到优化工艺参数为：底物浓度2 %，酶添加量24 000 U/g，酶解温度55 ℃，pH值为8，作用时间0.5 h；在该条件下羟自由基清除率平均值可达56.05 %。Xu 等［11］发现大豆粕可被中性蛋白酶有效水解生成抗氧化肽，且具有抗氧化活性的大豆肽大多有7个氨基酸。李琴等［12］系统研究了中性蛋白酶酶解绿豆制备抗氧化肽的工艺，得到了活性较强的抗氧化肽，其抗氧化能力低于VC高于BHT抗氧化剂。

（3）木瓜蛋白酶酶解法

木瓜蛋白酶又称木瓜酶，是一类琉基蛋白酶，具有特异性低、酶活高、热稳定性好等特点。徐艳等［13］利用木瓜蛋白酶水解猴头菌液体发酵菌丝蛋白，确定制备猴头菌抗氧化肽的最佳工艺条件为：加酶量80 U/m L，酶解时间1 h，温度50 ℃，pH值为6.0，在此条件下猴头菌丝多肽的还原力最强，多肽含量最高。Rao等［14］通过木瓜蛋白酶水解烟叶蛋白，发现相对分子质量为5 kDa的蛋白质水解物抗氧化活性最强，并认为其抗氧化活性与His、Met、Cys和Try的含量有关。Wang等［15］用木瓜蛋白酶水解麦麸蛋白，获得的水解产物具有较强的DPPH清除能力，在pH值为7时其抗氧化性几乎与VE相同，并确定86.5%活性肽分子量分布集中在4.2 kDa。

（4）胰蛋白酶酶解法

胰蛋白酶主要来源于猪、牛、羊等动物胰脏，可选择性水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链。王蓓等［16］以马铃薯渣为原料，从若干种酶中筛选出胰蛋白酶为最优水解酶，并确定最佳水解条件为：底物质量浓度40 g/L，加酶量7%，pH值为8.0，温度50℃，酶解时间90 min；该条件下马铃薯抗氧化肽对DPPH自由基的清除率为72.0%。Agrawal等［17］利用胰蛋白酶水解珍珠粟蛋白，通过凝胶过滤色谱分离出的珍珠粟抗氧化肽对DPPH自由基清除率为67.66%，对ABTS自由基清除率为78.81%，Fe2+的螯合率为51.20%，并确定抗氧化肽序列为SDRDLLGPNNQYLPK。

（5）复合蛋白酶系酶解法

蛋白酶是根据特定的作用位点对蛋白质进行水解，因此单酶对蛋白质的水解作用范围较小，采用双酶或两种以上的蛋白酶复合水解往往会取得更好效果。张秋萍等［18］利用中性蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解豌豆蛋白，得到了活性较高的豌豆抗氧化肽，当浓度为0.2 mg/m L时，对DPPH自由基的清除率达到62.03%。刘红梅等［19］将碱性蛋白酶和中性蛋白酶以2∶l的比例混合水解花生粕，在最优水解条件下花生肽收率为65.80%；当花生抗氧化肽质量浓度为0.55 mg/m L时，对DPPH自由基清除率为25.77%，分别比碱性蛋白酶和中性蛋白酶单酶水解提高了7.66%和22.53%。张丽霞等［20］用1∶1的碱性蛋白酶和胰蛋白酶降解麦胚，其产物对DPPH自由基的清除率达到50.16%，明显高于单酶酶解的效果。

1.2.2 发酵法 生物酶制剂法制备抗氧化肽虽然安全性高，但其水解过程通常伴随着一些苦味肽的产生，带来一些不好的感官体验。发酵是用于生产及保存食品的一种传统方法，不仅可以增加食品的营养保健价值，还会在一定程度上延长食品的保质期。由于发酵过程中微生物产生的端肽酶对小肽末端具有修饰作用，因此可避免苦涩味的产生并赋予食品天然的发酵香味，可广泛用于食品行业。秦卫东等［21］系统研究了黑曲霉发酵豆粕的工艺，并从发酵液中提取到了活性较高的抗氧化肽。王殿友［22］利用好食脉孢菌对脱脂葵花籽粕固态发酵制备抗氧化肽，确定最佳培养基为：脱脂葵花籽粕2 g，麸皮2.5 g，料水比1∶2.5，pH值为7.5，MgSO4添加量0. 02 g；最佳发酵条件为： 接种量1.0×106个/g，发酵时间5 d，温度30℃。在此条件下，发酵产物蛋白质溶出率为27.2%，抗氧化活性为186.37 U/mL。Ren等［23］利用黑曲霉发酵大豆得到腐乳，测得发酵产物对自由基清除能力达到50%。胡梦园等［24］利用枯草芽孢杆菌对大豆进行发酵，当接种量为4.0%、发酵温度为32℃、发酵时间为96 h时，豆粕抗氧化肽的转化率达到40.1%。

1.3 合成法

该方法可用于合成特定的蛋白质或多肽，主要包括化学合成、基因重组技术、酶促肽合成等。化学合成法中，由Merrifield创立并发展的固相合成多肽法（SPPS）奠定了多肽合成的基础。Murray等［25］采用微波辅助固相合成多肽，成功制备了酰基转运蛋白ACP；石伟等［26］采用固相合成法，成功制得生物活性肽SSDI。化学合成法适于合成中等长度肽链的肽，但合成率低、成本高、试剂毒性大；基因重组技术常用于合成肽链较长的肽，但技术尚不成熟，且表达产物的分离纯化相对困难；目前仅有酶促肽合成应用较为广泛。

2 抗氧化肽的活性评价

抗氧化肽的活性评价方法主要有3类：一是化学模型体系，即通过测定其对自由基的清除、对过渡金属离子的鳌和能力、还原力等反映抗氧化活性；二是生物亚细胞或动物组织匀浆体系，即引入ROS诱发体系模拟体内的氧应激损伤，通过测定一些重要的氧化、非氧化指标反映抗氧化肽的功能活性；三是动物实验法［2］。其中，体外的化学模型体系评价法由于操作简便、高效低毒、便于重复、实验周期短，损耗小等特点，经常作为体内实验的前期研究被广泛使用，在此将重点阐述体外化学实验体系。可根据清除自由基反应机制的不同将化学模型体系分为两类：一类是基于氢原子迁移（HAT）制定的方法，另一类是基于电子迁移（SET）制定的方法［27］。

2.1 基于氢原子转移法（HAT）

HAT适用于竞争性反应，可以反映抗氧化肽提供氢原子给自由基以猝灭自由基的能力大小。HAT具有反应速度快的特点，但前提需要排除其他还原性物质的干扰。氧自由基吸收能力（ORAC）测定和总自由基清除能力（TRAP）测定是HAT的两种主要方法，反应原理如式（1）所示［17］：

AH+X·→A·+XH （ 1）

ORAC法最初由Gheiselli和Glazer创建，是一种用以反映抗氧化剂抑制过氧化自由基以及通过提供氢原子阻断氧化反应能力的方法。该方法常以荧光素（FL）作为荧光探针，通过测定荧光强度衰减曲线下的面积变化，计算出目标样品的ORAC值。ORAC的优势在于高度自动化，可以测试样品对不同自由基的清除能力，检测结果较为准确，局限性是试验对温度和荧光标记物较为敏感。

TRAP常用来测定非酶抗氧化物质的抗氧化活性，其工作原理是通过2，2′-偶氮（2-脒基丙烷）盐酸（ABAP）产生过氧化物自由基，通过与抗氧化剂反应来评价样品的抗氧化能力，Trolox 当量（TEAC）常用来表示抗氧化剂的活性大小［1］。

2.2 基于电子迁移法（SET）

SET主要包括以下测定方法：二苯代苦味肼自由基清除能力（DPPH·）法、还原力法、总抗氧化能力（TEAC）法，其工作原理是通过测定抗氧化剂提供给金属离子、醛酮类化合物、自由基等单电子能力的大小来反映其还原能力。原理如式（2）所示［27］。

X·+AH→X-+AH+· （ 2）

2.2.1 DPPH·的清除能力 DPPH·常用来研究抗氧化肽的构效关系，其原理是：DPPH·的醇溶液呈紫色，且在517 nm处具有强吸收性。当体系中加入抗氧化剂后，其颜色会变浅，吸光值会下降。DPPH·的清除率通常与抗氧化剂浓度成正比，因此也可用IC50，即当DPPH·的清除率达到50%时抗氧化剂的浓度值来评定其抗氧化活性［23］。孙立等［28］将红花籽抗氧化肽溶液与DPPH·无水乙醇溶液混合，剧烈振荡后在室温下放置30 min测定吸光度，发现当红花籽抗氧化肽质量浓度为3 mg/mL 时，对DPPH·的清除率为57.86%。该方法快速方便，应用广泛，但反应机制较为复杂，不适于评定空间结构较大的抗氧化剂活性。

2.2.2 还原力法 还原力法反映了抗氧化剂提供氢原子或电子的能力大小，是评价抗氧化活性的重要指标。亚铁还原法（FRAP）和铁氰化钾还原法是测定还原力的主要方法。徐艳［13］等采用还原力法测定了猴头菌丝多肽的抗氧化活性，发现在最优试验条件下，肽的还原力可达1.035。

2.2.3 总抗氧化能力（TEAC）法 TEAC法的工作原理：2，2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（简称ABTS）与活性氧作用生成稳定的阳离子自由基ABTS+·，其水溶液呈蓝绿色。当体系中加入抗氧化剂后，由于阳离子自由基被捕获，体系褪色，在一定波长下混合体系的吸光值下降，且下降程度与抗氧化剂的抗氧化能力成正比。Janet等［29］采用TEAC法和还原力法研究了大豆多肽和扁豆多肽的体外抗氧化活性，发现两者均具有较高的ABTS+·自由基清除能力和还原力。

2.3 清除羟基自由基（·OH）的能力

对人体损伤较大的自由基主要有超氧阴离子（·O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）、单线态氧（1O2）、过氧硝酸盐等。其中，羟基自由基（·OH）是体内最活泼的活性氧，细胞缺乏相应的防御酶系，对生物体危害极大；此外，与DPPH和ABTS+·自由基相比，·OH具有更强的生物相关性。因此，羟基自由基的活性评定对自由基的研究具有重要意义。目前，主要测定方法有水杨酸法、脱氧核糖法和邻二氮菲法［30-31］。

2.4 金属离子螯合能力

过渡金属是许多自由基产生过程的催化剂。一般来说，生物活性物质的抗氧化能力与金属离子的螯合作用成正相关，因此可通过分光光度计测定吸光值来间接评定物质的抗氧化活性，目前主要有螯合铜离子法和螯合亚铁离子法。张东杰［32］发现大豆蛋白酶解物及其主要分离组分均具有一定的铜离子螯合能力，其中由16种氨基酸组成的大豆肽SP4效果最好。

2.5 抗脂质过氧化能力

硫代巴比妥酸（TBAS）法、亚油酸自氧化法（FTC，又称硫氰酸铁法）是检测抗脂质过氧化能力的常用方法。其中，TBAS法的实验原理是：TBAS和脂质过氧化反应的最终产物丙二醛（MDA）发生反应，生成的粉红色物质在波长532～535 nm 处有最大吸收峰［33］。因此，抗氧化肽抑制脂质过氧化能力主要体现在其抑制MDA产生的能力上。Zhang等［34］研究发现，酶解水稻胚乳蛋白得到的抗氧化肽不仅可以有效抑制脂质的自氧化，同时还含有明显的DPPH、超氧化物及羟自由基清除能力。

3 小结与展望

抗氧化肽是近年的研究热点，可食性植物源抗氧化肽因其优越的抗氧化活性和较高的安全性，在人类健康、食品加工、医药等领域具有广阔的应用前景。目前，尽管国内外学者对于抗氧化肽已经做了很多的研究，越来越多的抗氧化肽序列片段从可食性植物源中分离鉴定出来，但仍然有很多问题亟需解决，一是抗氧化肽的分离制备技术的高成本、低效率等局限性在一定程度上阻碍了抗氧化肽的工业化、商品化进程，因而探索新型高效并能规模化从植物源蛋白中制备抗氧化肽的方法迫在眉睫；二是利用体外活性评价方法筛选出的抗氧化肽其在消化系统的稳定性仍有待提高；三是抗氧化肽的作用机制仍需进一步挖掘和探明。

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（责任编辑：成 平）

Research Progress on An tioxidant Peptides from Edible Plants Source

KAN Xu-hui1，GUO Hong-ying1，2，TAN Xing-he1，2，LI Qing-m ing1，2
（1. College of Food Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC；2. Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology， Changsha 410128， PRC）

The antioxidant peptide is a kind of safe and reliable antioxidant， which can be w idely used in food industry. Antioxidant peptides from edible plants source have high development value and application prospect， which has become a hot spot in the research f eld in recent years. In this paper， the preparation methods， activity evaluation methods， problems and prospects of edible p lant antioxidant peptides were reviewed in order to provide reference for better development and utilization of antioxidant peptides from edible p lants source.

plant source； antioxidant peptide； preparation； evaluation method

TS214.2

A

1006-060X（2016）09-0111-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.09.030

2016-07-20

湖南农业大学科学基金项目（11YJ17）

阚旭辉（1995-），男，安徽明光市人，本科生，食品科学与工程专业。

郭红英