马志科，马 丽

(西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌，712100)

动物器官中肝素钠提取方法研究进展

马志科，马 丽

(西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌，712100)

肝素(heparin)是一族天然酸性黏多糖化合物，具有抗凝血、抗血栓、降血脂等多种生理活性，是防止动脉粥样硬化、心脑血管疾病的有效药物。论文介绍了肝素钠的理化性质，从动物器官提取肝素钠的盐解法、酶解法、酶解结合法等方法的研究进展，并对肝素钠的临床应用做了综述。

动物器官，肝素钠，提取方法，临床应用

肝素(heparin)是一族天然酸性黏多糖化合物，系麦克伦(Mclean)在1916年研究凝血问题时，从狗的肝脏中发现的。此后引起了人们的兴趣和关注，十几年后，又从牛肺中提取了肝素。肝素具有抗凝血活性，并作为临床应用的抗凝血剂[1]。从此以后，肝素钠作为抗凝血药物受到国内外广泛重视[2-3]。肝素是哺乳动物体内结缔组织的肥大细胞产生的，它广泛存在于各种器官组织中，如肝脏、肺脏、心脏、肾脏、胎盘、肠黏液和血液中。提取的主要原料为猪肠黏液和牛肺脏。常用的提取方法有盐解法、酶解法、酶解结合法等，本文对肝素钠的理化性质、提取方法进展及临床应用做一综述。

1 肝素钠的理化性质

肝素是一种酸性黏多糖，属于葡萄糖胺糖醛类物质，是由氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和硫酸酯聚合而成。因为肝素分子中有7个酸性集团，故呈强酸性并高度带负电荷，分子呈线形状态，其分子质量为3 ku～40 ku，平均分子质量为16 ku。肝素及钠盐为白色或类白色粉末，无毒无味，有吸湿性，易溶于水，不溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮等，但在乙醚中有一定溶解度。旋光度在+42～+56之间，波长在185 nm～220 nm处有特征吸收峰。肝素有两性化合物的特点，可与Na+、Ca2+等成盐，也可与HCl、苦味酸等成盐。肝素在酸性溶剂中不稳定，容易被酸水解，可被氧化剂氧化[4]。对酶稳定，分子中的羟基可以被酯化[5]。了解这些理化性质，对提取分离肝素有重要实际意义。

2 肝素钠的提取方法

自从发现和了解了应用价值后，人们在开始探索尝试肝素提取方法，并对提取工艺进行改进。目前提取肝素钠的方法有很多种，但实际常用的主要有盐解法、酶解法、酶解结合法等较为普通。

2.1 盐解法

肝素与蛋白质结合在一起，存在于哺乳动物肠黏膜、肺、肝等脏器内，提取的过程实质是去杂的过程。盐解法提取工艺，首先将动物肠黏膜破碎溶解，经氯化钠盐析，大孔阴离子树脂吸附，洗脱，其洗脱液用乙醇沉淀、脱水得粗品。粗品溶解后再经盐析，用脱色剂脱色，去除热源后沉淀，脱水干燥后得到肝素钠精制品。陈来同[6]经过多年研究，对传统提取肝素钠方法进行改进，对盐解温度、pH、树脂洗脱温度、乙醇用量等方面做了优化处理，总结了一种新的肝素钠提取工艺，效价可达110 U/mg。进一步对提取后的副产品综合利用做了阐述。姜平等[7]采用农场猪肠黏液小规模化提取肝素钠，根据实践经验小结出提取要点。郑川[8]采用新鲜猪肺或冷冻猪肺自然解冻后，放入绞肉机中连续绞两次，成糊状后，在充分搅拌下加入等量清水搅拌，用以提取肝素钠。任红媛等[9]对猪小肠肝素钠提取及精制做了一些改进，肠黏膜水解液的pH 10.0～11.0时，浆液变得浑浊且较黏稠，易堵塞D-254树脂孔，不利于吸附；而溶液的pH 8.7～9.5时，浆液澄清度较好，提高了树脂吸附率。通过精制处理，采用高锰酸钾和过氧化氢两步氧化，最后低温离心得到精品肝素钠。精品平均收率为0.74%，效价值为146.38 U/mg。除用小肠黏膜提取外，俞纯方等[10]从猪大肠腌液中提取了肝素钠，江燕等[11]也从牛肺中提取了精品肝素钠。师希雄等[12]在传统提取工艺上，结合微波辅助从羊肺中提取肝素钠，用正交试验确定最佳提取工艺条件。结果表明，最佳提取工艺为料液比1∶15，微波作用时间180 s，微波功率480 W，沉淀剂用量0.8%，肝素钠得率为294.78 mg/kg。关于树脂吸附方面，刘生峰等[13]比较4种阴离子交换树脂对肝素钠的吸附效果，研究表明FPA98型大孔树脂对肝素钠吸附率达92%。

盐解法提取肝素钠有一定传统优势，提取过程是在一定条件下，从动物器官肥大细胞中使肝素蛋白质复合物发生解离的过程。提取过程中影响因素很多，包括提取材料的新鲜程度，如材料污染有许多微生物会发酵分解肝素，还会产生一些有害物质使树脂中毒。研究发现，添加碱液可防止肠黏膜腐败。对来不及提取的黏液可用2.0 mol/L NaOH溶液调pH 9.5～10.0，置低温下作短期储存[14]。NaCl的合理用量，提取温度、时间、pH，吸附树脂选用和质量，洗脱等方面都对肝素钠质量有影响[15]。正确掌握工艺流程，把握好每个环节、操作注意事项等，就能提高肝素钠的产量和质量。

2.2 酶解法

肝素在动物器官是以肝素-蛋白质复合物的形式存在，除用盐解法外，还可通过酶解去除复合物中的蛋白质成分，游离出肝素。得到肝素钠粗品后，利用蛋白质水解酶除去残存的蛋白质，不仅能提高效价，而且能解蔽肝素活性释放，获得较高活性肝素钠。张耕[16]研究从牛肺中提取肝素钠工艺，用盐解工艺不能将肝素与蛋白质形成的糖蛋白完全分离，提取效果一般，采用胰蛋白酶酶解后再盐解获得较高的肝素收率。宋大巍等[17]也采用胰蛋白酶法提取肝素，并对工艺参数进行了优化研究。程林坤等[18]采用酶解法解离牦牛肺中肝素，提出粗品后，进一步去除其残存的结合蛋白质，使用胰蛋白酶降解成小分子肽，结合H2O2氧化法对肝素钠进行精制。通过L9(34)正交试验结合天青A比色法测定肝素钠效价，确定最佳工艺条件为：木瓜蛋白酶1∶5 000，酶解3 h，胰蛋白酶1∶2 000，过氧化氢1%，条件优化后产品效价为131 U/mg，产率可达1.92%。孙学超等[19]采用3种复合酶从肠渣中提取肝素钠，对比研究表明，木瓜蛋白酶和链蛋白酶复合酶提取肝素钠，效价为15 USPU/mg；胰蛋白酶和链蛋白酶复合酶效价为34 USPU/mg；2709碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶效价为39 USPU/mg。效价最高为2709碱性蛋白酶和胰蛋白酶，能有效提取肠渣中残留的肝素钠。

2.3 酶解结合法

近几年来，在酶解法提取肝素钠工艺中，结合其他方法进行综合提取，已获得高效价肝素钠精品。海文英等[20]采用碱性条件下酶解的方法，得到肝素钠粗提取液，再用膜技术除去粗提液中的杂质，后用D208树脂吸附工艺，纯化膜除杂浓缩液，最后用乙醇沉淀树脂洗脱液得到肝素钠。工艺流程为先变性，再用碱性酶解的方法，料液比为1∶1，温度为55℃，NaCl浓度为35 g/L，pH9.5，酶解时间为3.5 h。在这样较为温和的条件下，保持了在提取过程中肝素活性，采用膜技术对肝素钠粗提取液初步纯化，经过40℃条件下，操作压力为0.2 MPa的微滤膜，有效分离了溶液中的悬浮颗粒、大分子蛋白质、核酸等蛋白质。微滤膜滤液再进行两步超滤膜除杂浓缩，浓缩倍数为10倍，超滤对肝素钠的截留率为93%。对4种树脂选 用D280树脂吸附，最后用冷冻干燥的方法得到肝素钠产品，单位效价达160 U/mg。董洁等[21]以猪小肠黏膜为原料，通过酶解-树脂吸附/洗脱-膜分离-乙醇沉淀-干燥的提取工艺方法提取肝素钠。此工艺方法与传统的盐解-离子交换-乙醇沉淀法相比，该法分离肝素钠效价提高到160 U/mg，生产成本降低，工艺合理可行。

3 肝素钠临床应用

经分离提取的肝素钠，是一种天然抗凝血物质，具有抗凝血、抗血栓、降血脂等多种生理活性，是防止动脉粥样硬化、心脑血管疾病的有效药物。普通肝素经解聚制备成一类分子质量低于6 ku的总称为低分子肝素。临床常见有依诺肝素钠、达肝素钠、那曲肝素鈣等，低分子肝素与普通肝素相比较有明显的优势，分子质量越低，半衰期较长，抗凝血因子Xa活性越强，这样就使抗血栓作用与出血作用分离，保持了肝素的抗血栓作用，而降低了出血的危险。临床上用于预防和治疗血栓栓塞性疾病，如心肌梗死、血栓性静脉炎、肺血栓等，特别是预防普外手术和骨科手术中的高危病人。肝素钠提取工艺在不断改进，提取方法也日趋成熟。据中国产业调研网发布的《中国肝素钠行业发展前景分析及投资风险预测报告(2015年-2020年)》报导，我国肝素原料药供应量居全球首位，占全球供应量的50%以上。目前肝素是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，在血液透析治疗中是唯一有效的特效药物，低分子肝素具有更为广泛的临床医学用途。随着对肝素研究的不断深入，肝素制剂中还有低抗凝活性肝素，改构型肝素、类肝素等。这些药物特点是具有低抗凝高抗栓、作用时间长和出血作用少的优点，很有开发前途，肝素的应用领域还将进一步扩展。

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Progress on Extraction Methods of Heparin from Animal Organs

MA Zhi-ke, MA Li

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi, 712100,China)

Heparin is a family of natural compounds of acid mucopolysaccharide. It has a variety of physiological activities such as anti-clotting, preventing thrombosis, reducing blood fat and so on. It is a significant drug to prevent atherosclerosis and cerebrovascular disease. This paper summarized the chemistry and physical characters of heparin. It also made a literature review about clinical applications and research progress on extracting heparin from animal organs by salt precipitation, enzymatic hydrolysis, enzymatic hydrolysis combined techniques.

animal organ; heparin; extraction method; clinical application

2015-11-21

国家现代农业产业技术体系建设项目(CARS-38)

马志科(1960- )，男，陕西武功人，硕士，高级实验师，主要从事实验教学及科研工作。

S852.23

A

1007-5038(2016)05-0106-03