郝建伟, 张祥斌, 薛春宜,曹永长,*

(1.广东温氏食品集团股份有限公司广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室, 广东新兴 527400； 2.中山大学生命科学学院有害生物控制与资源利用国家重点实验室, 广东广州 510006)

专论与讲座

猪流行性腹泻防控研究概况

郝建伟1, 张祥斌1, 薛春宜2,曹永长1,2*

(1.广东温氏食品集团股份有限公司广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室, 广东新兴 527400； 2.中山大学生命科学学院有害生物控制与资源利用国家重点实验室, 广东广州 510006)

猪流行性腹泻病毒(PEDV)主要的致病特点是引起仔猪急性腹泻、呕吐、脱水及死亡，PEDV的感染也可引起怀孕母猪腹泻、厌食，从而影响母猪的正常繁殖功能。自2010年以来，PEDV变异毒株的流行已对全球的生猪产业造成严重影响，而已有的防控措施已经不能应对新的流行态势。近年来，针对PEDV变异毒株流行变化以及防控措施的研究越来越多，许多新的技术及手段已经应用到本病的控制中。论文以此为基础，分析了当前猪流行性腹泻病毒的流行特点，重点讨论不同检测方法和疫苗制剂的研究进展，以及其应用于变异毒株防控中的现状及前景。

猪流行性腹泻; 流行病学; 检测; 疫苗

腹泻对于养猪业的影响体现在持续性消耗猪体能和降低猪的经济性能。过去对于腹泻病的基本观点是细菌性腹泻难以根除，潜在降低饲料的回报率，病毒性腹泻虽能造成仔猪及成年猪死亡，但其流行传播途径有限，控制效果也较为显著。但2010年末中国暴发的大规模猪腹泻疫情让人们对腹泻病特别是病毒性腹泻有了新的认识[1]，猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)作为此次疫情的主要病原，最早暴发于1971年英国架子猪及育肥猪群，我国于1980年首次分离得到PEDV后，虽然陆续有多地报道PED的流行，但总体上可防可控。自2010年末，中国等亚洲国家暴发变异PEDV流行导致仔猪群发生大规模死亡，其后该病毒甚至传播至从未有流行记录的北美，并对当地生猪养殖造成重大影响[1]。而针对PEDV新的流行变化目前尚未深入研究。

PEDV具有特殊的致病机理，即病毒感染猪后仅在小肠内复制，导致细胞变性、肠绒毛脱落，致使体内水分外排，猪的电解质紊乱，最终死亡。致病机制本身并不复杂，但需要理解的是，母猪与仔猪的肠道是迥异的两个系统。更为复杂的是，仔猪发病常与母猪有关，而母猪免疫常用来保护仔猪，两个系统的交叉联系促使我们进一步分析母猪与仔猪肠道的差异，以便为传染源、传播途径及易感动物三方面提供更多参考，同时也为检测方法及疫苗应用找准对象[2]。近年来，新的技术不断应用到PEDV检测及新型疫苗的研究中，有效的疫苗加上合适的检测方法是PED防控的关键。因此，本文从PED流行变化、病毒流行传播、疫苗及检测方法研究进展三方面做一综述，希望能为PED的防控提供一些参考。

1 病原学

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种有囊膜单股正链RNA病毒，根据国际病毒分类委员会(International committee on taxonomy of viruses, ICTV)的分类指导，该病毒属于冠状病毒科冠状病毒属成员。电镜下观察完整的PEDV颗粒呈球形，具有囊膜，直径约为90 nm～130 nm，其冠状突出长约18 nm～23 nm，病毒对醚类及三氯甲烷等脂溶剂敏感，蔗糖浮力密度为1.18 g/mL。适应细胞的PEDV毒株在50℃条件下相对稳定，但在60℃条件下经30 min会失去感染性。病毒在4℃稳定保存的pH条件较广，范围为5.0～9.0，但在37℃条件下若需保持病毒稳定则要求pH在6.5～7.5，此外PEDV不具血凝活性。PEDV可通过口服接种仔猪后收集发病初期小肠组织来进行病毒繁殖及传代[3]。CV777是第1株适应Vero细胞并成功传代繁殖的PEDV，培养过程需在培养基中添加一定量的胰酶，其感染细胞特征病变为细胞合胞体及多核体[4]。由于PEDV适应细胞较为困难，因此细胞分离培养成功的毒株仍然较少。

2 PEDV的流行

1971年在英国育肥猪群中流行的腹泻，疫情呈周期性冬季发病，慢性消耗性病损等特征，并且常侵害种猪场。本病与传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)相似，但又很少会影响哺乳仔猪，这也是其区别于TGE病毒及其他肠道病原的最大特点。由于该病广为传播，因此也将其命名为流行性病毒腹泻(Epidemic viral diarrhea,EVD)。1976年EVD的流行有了新的变化，表现为不仅感染育肥猪，同时也可感染其他日龄的猪只，由于其具新的致病特点因此称之为EVD 2型。后经试验证实EVD是由冠状病毒引起的一种腹泻病毒病，该试验也分离到这种冠状病毒并命名为CV777[4]，此后以PED代替EVD来描述这种冠状病毒引发的病毒性腹泻。

1980年-1990年，PED主要在比利时、英国、德国、荷兰及瑞士等欧洲国家流行，其后亚洲成为PED流行的高发区，并且传播速度更快，程度更严重。1993年-1994年，日本暴发PED导致14 000头猪死亡，哺乳仔猪死亡率高达30%～100%，而成年猪发病轻微，仅出现短暂的食欲下降及泌乳量降低。1992年-1993年韩国暴发的病毒性腹泻病例中56.3%是由PEDV引起，明显高于猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis coronavirus，TGEV)的危害，1996年冬季，39 509头仔猪死于PEDV导致的腹泻[5]。大量临床数据显示亚洲PED的发病常集中在仔猪群(<10日龄)。

我国在1980年即有PED流行的相关报道，其后CV777灭活疫苗的研制及现地应用使得疫情得以控制，因此该病对我国养殖业的影响并不明显。自2010年末，变异PEDV在国内迅速传播并造成巨大的经济损失，而与之类似的病毒传播至北美等国家，对当地养猪业造成重大影响，特别是对于从未有PEDV流行历史的美国来说，变异毒株蔓延至多个州后，不仅造成仔猪群大规模死亡，同时在流行的过程中不断变异产生新的毒株，不同毒株发病特点均有不同[5]。本实验室利用近年来流行毒株数据对变异毒株进化方式进行分析，发现基因突变和基因重组均是PEDV变异的方式，但基因突变是PEDV变异进化的主要手段。

PEDV的传播方式主要为母猪-仔猪粪口传播，但近年来的研究报道显示该病存在饲料源性及干粉传播两种间接方式，这表明PEDV传播的距离范围可随传播方式的多样性而有所扩大。但母猪作为传染源通过粪口传播仍是本病主要的传播模式，需以其作为主要研究对象。PED的临床症状与TGE相似，PED处于流行高峰时期，1周龄以内仔猪感染后常死于腹泻导致的脱水。流行高峰后，仔猪则呈现厌食、精神沉郁、呕吐及水样腹泻等症状，但血便较为少见。断奶猪或架子猪则呈现顽固性、重复发生的水样腹泻，可造成生长迟滞，但死亡不常见。PEDV造成的病理损伤集中在小肠，剖检可见小肠内充满黄色液体、肠壁变薄及肠绒毛脱落[6]。

3 PEDV病原及抗体检测

3.1 PEDV病原检测

常见病毒性腹泻病原有PEDV、TGEV和猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PoRV)等，不同病原引起的临床症状和病理变化常难以区分，因此利用实验室检测方法对PEDV进行鉴别诊断十分必要。病毒分离目前是诊断病毒病的金标准[7]，但是对PEDV而言病毒分离常难以操作；电镜直接观察及免疫电镜也用于PEDV的诊断，但操作复杂难以应用；其后免疫荧光试验(immunofluorescence，IF)、免疫组织化学技术(immunohistochemical techniques，IHT)及酶联免疫吸附试验(ELISA)也被用于PEDV的检测，然而这些检测方法具有费时耗力难以普及或敏感性及特异性难以达到相应要求的缺点[8]。

新的技术方法为PEDV的检测带来新的选择，Kim O等[8]比较RT-PCR、免疫组化及原位杂交方法应用于本病检测，发现尽管RT-PCR方法对PEDV的检出率会更高，但是只有用福尔马林固定组织切片，应用免疫组化检测到抗原，或利用原位杂交检测病毒核酸才是有效的PEDV检测方法。其后，基于不同基因建立的RT-PCR方法成功应用于PEDV的检测，已有商业化的一步法RT-PCR诊断试剂盒应用于PEDV诊断。此外，基于RT-PCR方法，结合病毒载量标准曲线，也可用来判断PEDV的流行。多重RT-PCR则可用于PEDV的鉴别检测[9]。另一种有效的检测方法是RT环介导等温扩增技术(RT-loop mediated isothermal amplification，RT-LAMP)，研究显示这种方法比RT-PCR及ELISA具更高敏感性，同时该方法结合新技术后可达到快速、简便、可视的效果[10]。

实时荧光定量PCR检测方法更为特异及灵敏，Kim等建立了检测PEDV和TGEV的实时荧光定量PCR，而依据ORF3特点设计引物区分强弱毒株的实时荧光定量PCR方法则更易于鉴别疫苗毒和野毒。实时荧光定量PCR方法易受毒株差异影响，因此需选用保守基因片段或根据流行毒株特点及时更新检测引物序列。本实验室通过分析2010年以来变异毒株基因序列，发现之前方法所用引物及探针并不能与当前流行形势匹配，因此重新设计了符合变异毒株特点的探针及引物，建立了可检测经典毒株和变异毒株的实时荧光定量RT-PCR方法。也有研究团队利用实时荧光定量方法的敏感性及特异性，建立了可特异性检测包括PEDV在内的多种病原检测方法[11]。目前，由于定量检测方法具备更高的灵敏度和特异性，同时，随着检测仪器在养殖一线的普及，本方法在PEDV抗原及鉴别检测中的作用会越来越大。

3.2 PEDV抗体检测

阻断ELISA及间接IF方法常用于检测接种后7 d及10 d～13 d猪只的血清抗体，两种检测方法均要求血清样品保存及检测时间不超过2周～3周。应用两种方法可进行抗体的消长规律监测。由于黏膜免疫系统的独特性，因此血清抗体滴度并不常与肠道疫病的保护率呈良好相关，血清抗体的测定更倾向于验证猪只的感染史，特别是在感染早期，及时检出感染猪只将有助于与疫病的防控。中和试验(serum neutralizing antibody test，SNT)是病毒性疫病中和抗体检测的“金标准”。有研究认为乳汁IgA浓度比血清中和抗体滴度可更好的体现猪只抗PEDV的能力，并据此开发了可用于检测粪便及口拭子中IgA的方法[12-13]。但也有报道称血清抗体被动免疫仔猪后，可以为仔猪提供一定程度的攻毒保护[14]。更重要的是，群体血清中和效价的监测有助于判断猪群整体的抗PEDV的能力。因此，基于乳汁或口拭子等体液检测IgA有助于体现个体抵抗PEDV的能力，而基于群体血清抗体检测则适用于判断免疫及感染状态。

4 PED疫苗

目前，尚无有效的药物可以针对PEDV进行治疗，合适的疫苗及合理的免疫程序是预防PED的重要措施。PEDV依据不同基因或基因组可分为多个进化分支，但从血清学分型角度判断则当前仅有一个血清型，常用的疫苗主要有灭活疫苗和活疫苗两类。PEDV肠道局限性感染的特点决定了该病免疫预防的困难，对除哺乳仔猪以外的猪群来说，肠道黏膜免疫具有非常重要的作用。抵抗PEDV的感染往往依靠黏膜分泌的IgA，这就要求疫苗研发的重点为有效提高肠道免疫水平[15]。而对于仔猪来说，由于胎儿上皮绒毛膜胎盘在母猪妊娠期形成，乳猪出生后消化道在短短的几周内会经历一系列变化，例如，采食初乳的24 h内，猪胃、胰腺和小肠会快速生长，乳猪要快速适应从胎盘营养到肠内营养的转变，这一过程是复杂、快速突然的。在这一时期，胎儿肠道具有特殊的生理特点，出生后48 h内的仔猪，肠道能够直接摄取大量的大分子物质，肠道这种胞饮作用没有选择性，在出生后的48 h以后逐渐停止(称作肠道关闭)。这一生理特点既有利于大分子免疫球蛋白的直接吸收，可尽快通过被动免疫保护仔猪免受疫病侵扰，同时也为抗原或致病性大分子的非特异吸收提供便利。与此同时，尽管仔猪出生时就存在免疫系统的分子成分，但其在数量及功能上仍不成熟。此外，胃肠道pH等非特异屏障并没有完全建立使得病原分子更易乘虚而入。因此，仔猪需从母乳特别是初乳中获得抵抗力，而初乳中IgA抗体的含量比例则又较为恒定[16]，因此，如何利用肠道免疫-乳房免疫这一免疫轴线提升抗PEDV抗体含量则是本病免疫机制研究的难点。

4.1 PED弱毒疫苗

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所于“九五”期间完成了“猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联弱毒疫苗”的研制，应用于养猪生产可有效降低国内两病的发生率。亚洲各国先后对弱毒疫苗进行研究，日本的P-5株、韩国的DR13毒株经连续传代致弱后，均有相关研究证实其免疫效果。其中，DR13强毒株经100代连续传代后在仔猪体内回传3代后依然安全，2004年attenuated DR13已作为口服疫苗用于预防韩国PED，临床应用表明，口服比注射更有效，怀孕母猪免疫后可为仔猪带来较高被动免疫，该疫苗已于2011年在菲律宾注册并商品化生产[17]。

4.2 PED灭活疫苗

PED弱毒疫苗作为活疫苗在效力及安全性等方面仍需进一步深入长期的验证。而以CV777为代表的灭活制剂则作为PED的防控主力一直沿用至今。王明等[17]通过免疫接种试验研究CV777免疫效果，发现疫苗经后海穴注射后，其主动保护率为85%，被动保护率高达97.06%，免疫力产生时间开始于接种后两周，免疫保护期可达半年。其后，马思奇研究员则进一步简化CV777的培养操作，利用Vero细胞繁殖28代CV777病毒，灭活后以氢氧化铝为佐剂制备灭活疫苗，比较肌肉注射及后海穴注射效果，发现后海穴免疫效果优于肌肉接种，对仔猪主动免疫保护率达85.19%，而被动保护率也可达85%。由于PEDV相对难以分离，因此CV777长期应用于全球PED防控。PED在亚洲流行后，也有个别毒株用于PED灭活疫苗的研究，如韩国毒株KPEDV在Vero细胞上连续传代至93代，其对新生仔猪的致病力降低，对妊娠母猪安全，因此也有相应产品问世，为PED的防控提供了新的选择[17]。

但近年来，不论是经典疫苗如CV777，或是变异毒株灭活疫苗免疫后均不能提供显著且稳定的保护，因此，有学者提出灭活疫苗具有局限性，只能刺激产生体液免疫，不能产生良好的细胞免疫，因而不能对PED产生好的保护。但有研究表明PED灭活疫苗可以明显激活T细胞的增殖[18]，同时，Baek及本实验室的研究结果表明，疫苗毒株的匹配度和疫苗剂量可影响猪只的免疫及攻毒效果。据此，灭活疫苗的研究仍是PED防控的重要内容，其中剂量、毒株以及佐剂可能是未来研究的重要突破点[19]。

4.3 PED新型疫苗研究

PED新型疫苗研究的思路主要是利用不同载体表达已鉴定的抗原区域。抗原通过不同的递送途径，刺激肠道黏膜免疫系统达到免疫预防的效果，如Bae等2003年将PEDV中和区域COE基因构建到烟草表达系统中，利用表达的抗原口服免疫小鼠，可有效诱导小鼠产生体液及黏膜免疫力。其后在无尼古丁的烟草中表达PEDV COE基因，COE抗原的表达量占全部可溶性蛋白的2.1%，解决了Bae等抗原表达量低的缺点[20]，这种方法既解决了抗原向肠道的递呈难题，又可将转基因植物作为饲料原料进行添加，为食用转基因植物疫苗的研究提供了良好思路。

虽然转基因植物，如烟草、马铃薯、番茄等具有上下游技术成本低廉，容易扩大培养等优点。但是不足之处也显而易见，如翻译后修饰的缺乏，体内运输过程中抗原的不稳定性以及表达量低等一直困扰着植物载体疫苗的研究与推广。另一种方案是利用微生态制剂中的益生菌表达抗原，宿主菌在肠道中增殖，即可促进畜禽消化，同时表达的保护性抗原又可刺激肠道黏膜免疫系统产生保护力[21]。有研究利用干酪乳酸菌表达载体成功表达PEDV N蛋白，经鼻内及口服接种小鼠和怀孕母猪后虽未检测到抗PEDV中和活性抗体，但哺乳仔猪IgG水平明显升高。利用干酪乳酸杆菌表达N蛋白及中和表位区域，口服免疫小鼠后测定其免疫反应，发现两者均可刺激肠道产生免疫应答，经口免疫的小鼠可产生特异的体液免疫及细胞免疫[22]。尽管细菌表达系统的蛋白表达量可以高达1g/L，但多数试验制品由于缺乏免疫原性，甚至没有免疫原性而无法进入市场。虽然有研究探索PEDV抗原蛋白的可溶性表达来提高免疫原性，其结果也表明小鼠免疫后可产生IgG，但应用于猪只的试验则未见报道[23]。总体来看，原核表达系统具有天然缺陷，如修饰能力的缺乏及不能进行糖基化等，而这恰恰是高效疫苗关键需求。此外，可溶性表达比例、无法表达全长的同时将毒素、热激蛋白或伴侣蛋白去除等，既影响下游目的蛋白的分离纯化，也提高了最终产品的成本。

也有研究利用真核表达系统表达PEDV S1，并比较了不同系统表达蛋白的免疫效力，结果显示免疫组在症状及死亡较对照组有所减轻，但并无显著差异[24]。本实验室利用杆状病毒表达系统表达了变异毒株S蛋白全长，免疫仔猪后攻毒，结果与上述试验相似。因此，就目前研究结果来看，利用真核系统研究PEDV亚单位疫苗还需进一步改进完善。另一方面，Meng F等[25]研究利用真核表达系统，构建含有S基因的DNA疫苗，结果显示该疫苗可以有效激发细胞免疫并介导产生高滴度抗体。被动免疫是保护仔猪免受PEDV侵袭的另外一种方式，特异性的抗PEDV IgY一直以来是被动免疫研究的重要内容，试验结果显示，应用抗PEDV IgY执行被动免疫的仔猪存活率为49.24%，高于对照组存活率(33.71%)[26]。

综上所述，PEDV既具有冠状病毒科常见的特点，如免疫原性差、易变异等，又仅对小肠造成局限性病变，导致目前已有检测手段、免疫制剂及防控思路不能有效控制病毒的侵染。PED的成功防控有赖于黏膜免疫系统的深入了解，在此基础上，一方面，需要借鉴不同黏膜疫病防控的经验和思路，例如肺炎支原体致病特点与PEDV具有某些同源性，肺炎支原体的有效防控有赖于疫苗佐剂及免疫方式的突破；另一方面，需借鉴研究成熟的冠状病毒经验，例如鸡传染性支气管炎病毒，研究表明冠状病毒普遍存在抗原性差、抗原易失活等特点。因此，研究PED疫苗免疫的同时，既要关注病毒的变异和分型，还要重点考虑病毒的稳定性及病毒免疫的剂量。病毒性疫病防控的核心始终需围绕动物疫病防控三要素(传染源、传播途径及易感动物)来开展。有效疫苗的研制、准确简便的抗原抗体检测方法以及病毒的传播途径是未来PED成功防控的必要条件。

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Progress on Controlling Porcine Epidemic Diarrhea

HAO Jian-wei1, ZHANG Xiang-bin1, XUE Chun-yi2, CAO Yong-chang1,2

(1.GuangdongWen'sFoodstuffsGroupCo.,Ltd.,GuangdongKeyLaboratoryofLivestockandPoultryHealthyandEnvironmentalControl,Xinxing,Guangdong,527400，China;2.StateKeyLaboratoryofBiocontrol,SchoolofLifeSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou,Guangdong,510006,China)

The main pathogenic characteristics of porcine epidemic diarrhea virus are acute diarrhea, vomiting, dehydration and death in suckling piglets, and virus infection can also cause, diarrhea, anorexia in pregnant sows, thus affect the normal sow breeding rule. Since 2010, the prevalence of mutant strain has serious effects on global pig industry, however, the existing prevention and control measures can't cope with the new trend. In recent years, more researches focused on the study of the new prevalent strains as well as the prevention and control measures, many new techniques and methods have been applied to the control of the disease. Based on this basis, this article analyzed the epidemic characteristics of porcine epidemic diarrhea, focused on different testing methods and the research progress of vaccine formulation, and its application in present situation and prospect of prevention and control of mutant strain.

porcine epidemic diarrhea; epidemiology; detection; vaccine

2016-04-21

郝建伟(1983-)，男，山西大同人，博士，主要从事动物病毒学研究。 *通讯作者

S852.659.6

A

1007-5038(2016)12-0100-06