吐尔洪江·瓦哈甫　沈灏　张先龙

200233，　　上海交通大学附属第六人民医院骨科



表皮葡萄球菌引起假体周围感染的生物膜形成机制

吐尔洪江·瓦哈甫沈灏张先龙

200233，上海交通大学附属第六人民医院骨科

摘要关节假体周围感染是人工关节置换术后严重的并发症之一。流行病学研究发现，表皮葡萄球菌是导致假体周围感染的最主要致病菌之一。感染过程中，细菌通过在植入物表面定植形成生物膜，从而有效逃避抗生素和宿主免疫反应，并通过群体感应系统调节生物膜的成长过程。该文就表皮葡萄球菌引起假体周围感染的生物膜形成机制作一综述。

关键词表皮葡萄球菌；假体周围感染；生物膜；群体感应系统

假体周围感染的发病率不高，一般仅为1%～2%[1]，然而一旦发病，不仅可增加患者致残率和致死率，还会延长住院时间、增加住院费用，给患者和社会带来沉重的经济负担。因此，积极探究假体周围感染的发病机制，尤其是致病菌生物膜形成机制，对提高人工关节置换术的成功率和治疗效果意义重大[2]。

1假体周围感染特点

假体周围感染的显著特点之一是在假体存在时很低数量的细菌即可导致感染形成。动物实验表明，在出现异物的情况下，形成感染所需的细菌浓度可以降低105倍。大量研究[3-4]发现，关节假体是异物，而这与细菌在假体表面形成生物膜有关。细菌通过直接感染假体表面、感染邻近组织及血源性播散感染等途径导致假体周围感染[5]。

引起假体周围感染的病原体在不同国家和地区有所不同，在美国最常见的病原体是金黄色葡萄球菌，其次是表皮葡萄球菌，而在欧洲和中国引起假体周围感染的主要病原体是凝固酶阴性葡萄球菌，其次是金黄色葡萄球菌[2,6]。据统计，人工关节置换术后感染病例中47%为凝固酶阴性葡萄球菌感染，19%为金黄色葡萄球菌感染，而凝固酶阴性葡萄球菌感染中表皮葡萄球菌感染最为常见[7]。

2表皮葡萄球菌及其分子流行病学

正常情况下，表皮葡萄球菌是定植在皮肤和黏膜上的共生菌，为人体含量最多的葡萄球菌。流行病学研究[8]显示，正常人携带的表皮葡萄球菌菌株数量为10～24株。表皮葡萄球菌成为最常见的假体周围感染致病菌的原因为：①表皮葡萄球菌广泛定植在所有人群的黏膜上皮；②表皮葡萄球菌可以形成生物膜并定植在生物材料表面，形成抗生素耐药和免疫逃逸[9]；③表皮葡萄球菌群体可以形成有机整体，通过群体感应功能调节进一步适应周围环境变化[10]。这些因素增加了假体表面表皮葡萄球菌感染的预防和治疗难度。

由于不同细菌亚型克隆的黏附材料表面、形成生物膜、免疫逃逸、对抗治疗的毒力因子和调节毒力因子等方式有所不同[11]，因此进行分子流行病学研究，在分子或基因水平阐明细菌种类和分型，进而研究感染机制，对感染控制和治疗有深远意义[12]。有学者[13]对表皮葡萄球菌进行基于测序分析的多位点序列分型(MLST)研究，发现最常见的假体周围感染临床分离株是ST2和ST215，这可能与这些细菌高度多重耐药性和生物膜形成有关。虽然表皮葡萄球菌的核心基因序列与金黄色葡萄球菌相似，但缺乏毒力因子和致病岛。比较研究发现，参与表皮葡萄球菌引起假体周围感染生物膜形成的核心基因有ica、app、altE、sdrG、agr、luxS等。

3生物膜组成与作用

生物膜是依附于假体表面并由胞外多聚物和基质网包被的高度组织化和系统化的复杂微生物群落。群落可能由单种细菌组成，也可能由多种细菌组成，但即使是由单种细菌组成，其不同亚型细菌的基因型和表现也各不相同。在生物膜内，这些微生物逐渐形成结构功能不同的复杂群落，具有许多类似高等生物组织的功能[14]。生物膜细胞外基质成分较复杂，主要由多糖、蛋白质、磷壁酸和细胞外DNA组成，其组成部分在不同个体，甚至同一个体不同生物膜之间的差异很大。在生物膜保护下，膜内细菌可有效逃避抗生素的杀菌作用和宿主免疫反应，较浮游细菌拥有多达1 000倍的抵抗能力[15]。这种内在保护机制是多样的，即使在同种抗生素和宿主内，其机制也会有所不同。首先，生物膜构成一道机械屏障，使免疫细胞很难进入膜内，并抑制吞噬细胞的吞噬作用。生物膜可以限制某些抗生素的扩散，如金黄色葡萄球菌限制环丙沙星在生物膜中的扩散，但也可以促进部分抗生素在生物膜中的扩散，如利福平、万古霉素和达托霉素等可在表皮葡萄球菌生物膜中扩散[16]，因此可以尝试利用这些药物治疗感染。其次，生物膜内的细菌处于休眠状态，在这种状态下细菌细胞分裂、蛋白合成、核酸复制等代谢活动减弱。这种特点使许多通过干扰细菌上述代谢活动的药物作用减弱[17]。最后，生物膜过表达的蛋白或生物多聚体可能在耐药性方面起到重要作用。

4生物膜形成机制

生物膜生长过程是一动态变化过程，可分为黏附、聚集、成熟和脱落4个阶段。生物膜的形成始于细菌在黏附分子、表面张力及静电作用下的表面黏附，然后细胞聚集并合成胞外多糖，经过结构分化发展为成熟的生物膜，最后生物膜在周围环境影响下发生脱落，释放浮游细菌，形成新的感染灶[10,18]。

4.1黏附

细菌可以直接黏附到生物体或非生物体表面，其黏附到非生物体如假体或移植的医疗器械表面依赖于内植物和细菌的物理生化性质，主要通过疏水性和静电作用介导[10]。此外，一些特殊的蛋白如自溶素E和表皮葡萄球菌自溶素Aae也参与细菌直接黏附到非生物体表面的过程。自溶素E和Aae特异性较低，可与纤维蛋白原、纤连蛋白和玻连蛋白非特异性结合[19]，还可促使细菌释放细胞外DNA，在表皮葡萄球菌生物膜形成中起到重要作用[20]。当假体植入体内时，血清蛋白(包括纤维蛋白原、纤连蛋白、胶原蛋白和玻连蛋白等)快速覆盖到假体表面，表皮葡萄球菌通过表面蛋白与血清蛋白相互作用间接黏附于假体表面。表皮葡萄球菌有许多表面蛋白，这些表面蛋白被称为细菌表面识别黏附基质分子(MSCRAMMS)，MSCRAMMS可与血清蛋白和组织蛋白相互作用。目前研究最广泛的MSCRAMM是Sdr家族蛋白。Sdr家族蛋白是一类细菌表面蛋白，属于含有丝氨酸-天冬氨酸重复序列的基因编码蛋白。这个家族包括3个成员，即SdrF、SdrG、SdrH。表皮葡萄球菌可通过SdrG和SdrF分别与纤维蛋白原和胶原蛋白共价结合。体外实验显示，SdrG是表皮葡萄球菌黏附到纤维蛋白原的必要条件。在体内SdrG表达增加时，抗SdrG抗体即会出现，sdrG基因敲除可导致表皮葡萄球菌黏附纤维蛋白原表面的能力下降，因此SdrG感染对于表皮葡萄球菌感染过程非常重要[20-21]。研究[22]表明，SdrG具有促进血小板黏附和聚集的作用。

此外，胞外基质结合蛋白(Embp)是一类能与细胞外基质结合的大蛋白，它的相对分子质量为1 100 000，具有细胞间黏附的特性。研究[23]发现，Embp亚型(相对分子质量460 000)可结合纤连蛋白，不但可以在icaADBC阴性和聚集相关蛋白(Aap)阴性的细菌亚型中调节生物膜的黏附和聚集，而且可以抵抗吞噬细胞的吞噬作用，促使细菌生物膜形成。

4.2聚集

已黏附的细菌通过分裂增殖使生物膜增厚，并合成多种胞外多聚物如多糖胞间黏附素(PIA)、Aap和磷壁酸等将细菌包裹在内，同时形成通道与空隙供细菌进行物质代谢与信息交流。PIA又称为多聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG)，与表皮葡萄球菌致病性密切相关，不仅参与生物膜形成、介导免疫逃逸、提高表皮葡萄球菌耐药性，还影响生物膜三维结构。PIA由ica操纵子编码的酶蛋白催化合成，ica基因座包含icaA(1 238 bp)、icaD(305 bp)、icaB(869 bp)和icaC(1 067 bp)4个功能基因[24]，以及在ica基因座上游具有负性调节作用的icaR基因(557 bp)。IcaA与IcaD结合，可使活化的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)单体产生1条链，该链的延长依赖于IcaC，并在IcaB作用下脱去乙酰基，最终合成PNAG[24]。ica操纵子的转录调节因子有很多，包括SarA、SarZ、LuxS、ClpP等。

尽管在多数细菌中PIA对生物膜的形成是必需的，然而仍有部分细菌在没有ica基因编码PIA的情况下也能形成生物膜，这类细菌的PIA由其他蛋白如Aap、生物膜相关蛋白(Bap/Bhp)和Embp等替代，可能与纤连蛋白形成有关[22,25]。Aap是一种相对分子质量为20 000的LPXTG蛋白序列，包括N-端A区域和B区域128个可变重复序列。它的聚集作用是通过细菌和宿主的蛋白酶活化来实现。它的聚集由邻近细胞B区域Zn2+依赖的二聚体激活，A区域则介导黏附到角质细胞，这可能与表皮葡萄球菌黏附到皮肤有一定关系[25]。磷壁酸是革兰阳性菌细胞表面的特征性组成部分，它们可能通过经典作用与其他表面多聚物相互作用，形成复杂的网状结构。作为一类多聚阴离子分子，磷壁酸具有保持阳离子平衡、为细胞壁蛋白提供锚定基础、调节自溶酶活性等作用[26]。在磷壁酸存在的情况下，胞外DNA所带的负电荷在与其他表面结构相互作用过程中起到重要作用[27]。

4.3成熟

生物膜内的细菌转录反应与指数生长状态下的细菌完全不同。实验表明，生物膜内葡萄球菌的代谢方式主要转向无氧代谢和微需氧代谢，且下调蛋白质、细胞壁和DNA合成。生物膜内的细菌对其周围环境具有时间和空间反应。Rani等[28]研究发现，生物膜内的表皮葡萄球菌至少有4种生长状态，即有氧生长、无氧生长、休眠细胞和死亡细胞。在此基础上，破坏特定时期的生物膜可能增加细菌对抗生素的敏感性。在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜中，精氨酸脱亚胺酶(adI)操纵子表达常发生上调[16]，其介导的精氨酸代谢在细菌代谢状态转变为厌氧生长过程中起到重要作用。

多个研究表明，部分不产生PIA/生物膜的菌落发生表型变异。产生PIA的菌落呈粗糙的不规则状，而不产生PIA的菌落呈光滑的奶油状。表型变异是生物膜成熟的结果。Ziebuhr等[29]研究发现，30%的表型变异由IS-256插入ica操纵子引起。Handke等将非IS-256导致的表型转换分为3类：Ⅰ型表型变异为icaADBC的转录水平下调导致几乎无PIA合成；Ⅱ型表型变异为icaADBC转录水平无明显变化，但不产生任何PIA/生物膜；Ⅲ型表型变异为染色体大片区域缺失。然而，部分Ⅰ型和Ⅱ型表型变异的菌株在胰酪胨大豆培养基中充分培养可重新表达生成野生型菌株生物膜的能力。有研究[30]对表皮葡萄球菌SE5的3种变异类型进行DNA测序，发现SE5 PV2(Ⅰ型表型变异)为rsbU突变，SE5 PV3和SE5 PV10(均为Ⅱ型表型变异)分别为icaA和icaD突变，这些不同的变异亚型拓宽了微生物群落的生存条件范围。

4.4脱落

在葡萄球菌生物膜成熟过程中，一些细菌或细菌团从生物膜上脱落，并随着血流等转移到其他器官，进而形成急性非生物膜性感染如菌血症等。目前研究表明，表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌脱落和扩散过程依赖于agr基因，主要由agrB、agrD、agrC、和agrA基因簇形成。在兔模型中，agr突变的表皮葡萄球菌生物膜更厚，定植的细菌更多[30]。agr突变的表皮葡萄球菌生物膜增厚可能与酚溶解调控蛋白(PSM)有关[31-32]。PSM包括δ-毒素、PSMα和PSMβ，这些分子可作为表面活性剂，在生物膜表面抑制细菌的非共价结合。PSMβ可能可促进生物膜相关感染的播散。此外，抗PSMβ抗体可阻碍生物膜表皮葡萄球菌播散[32]。

5表皮葡萄球菌群体感应效应对生物膜的调控

细菌表面分子的群体感应依赖现象在许多细菌生物膜形成和脱落过程中普遍存在。群体感应系统以细胞密度依赖的形式控制基因表达。目前辅助基因调节系统agr和luxS QS系统是最主要的两个感应系统。表皮葡萄球菌的agr群体感应系统可以调节生物膜形成，该系统包括自诱导蛋白(AIP)、转出酶(AgrB)和信号转导系统(AgrC、AgrA)[33]。agr群体感应系统调控靶基因由DNA结合蛋白AgrC或RNA Ⅲ直接调控。AIP是长度为7～9个氨基酸的多肽，含有保守的丝氨酸残基，AIP可结合AgrC并促进AgrC的自身磷酸化，反过来引起AgrA磷酸化和活化。AgrA活化P2启动子，控制agrB、agrD、agrC和agrA的表达，最终关闭群体感应循环。同时，ArgA活化P3启动子能促进RNA Ⅲ和δ-毒素的表达[24,33]。一般来说，除非两个种群非常相近(Ⅰ型和Ⅳ型金黄色葡萄球菌)，大多数自身种群的AIP激活agr反应，而不同种群的AIP抑制agr反应。Ⅰ型表皮葡萄球菌的AIP可抑制除少见的Ⅳ型金黄色葡萄球菌之外所有类型金黄色葡萄球菌的agr反应，然而只有Ⅳ型金黄色葡萄球菌的AIP可以抑制Ⅰ型表皮葡萄球菌的agr反应。因此，在群体感应系统的相互抑制过程中，表皮葡萄球菌可能占有优势，但尚无证据证明其在表皮葡萄球菌体内增殖的过程中起作用[34]。

生物膜外层的agr表达可促进生物膜的脱落和再生长，而agr基因同时也在生物膜表面表达，这对于生物膜隧道的形成非常重要。虽然agr群体感应系统是生物膜成熟过程的主要调控因素，但不能调控PIA合成[10]。luxS QS系统广泛存在于细菌中，其催化合成的自体诱导分子2(AI-2)能实现种内和种间交流。研究[35]发现，luxS QS系统在表皮葡萄球菌生物膜形成中起负调控作用，调控机制与ica操纵子依赖性通路有关，其突变能抑制ica的转录，并通过改变PIA合成来调控生物膜形成。

6展望

随着人工关节置换术应用的增多，表皮葡萄球菌引起假体周围感染机制被广泛研究。探讨表皮葡萄球菌生物膜形成机制及其相关调节因子对于预防和治疗假体周围感染具有非凡意义。但目前对表皮葡萄球菌生物膜的认识十分有限，尤其对各基因调控和功能尚缺乏科学有效的体外实验证据，需要建立更好的动物感染模型，在分子基因水平上进一步研究表皮葡萄球菌的致病机制。

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(收稿：2015-09-09; 修回：2015-12-17)

(本文编辑：卢千语)

第二届国际骨科讲师团教育峰会——霍普金斯专场通知

第二届国际骨科讲师团教育峰会(OES)——霍普金斯专场将于2016年4月15-17日在西安举行，由美国霍普金斯大学医学院、第四军医大学国际骨科教育学院与《中华创伤骨科杂志》联合举办。峰会的课程设置、模式与操作均由美国霍普金斯大学医学院骨科全程实施，突出教育的国际化、标准化特点。本届峰会着力打造四大亮点：①霍普金斯大学讲师全程授课，着力面向中青年医生讲授骨科基本、原则、关键点和难点；②疑难病例会诊、影像学资料解析，中美双方专家将分别提供(参会医生亦可提供)创伤、脊柱、关节等领域的疑难病例(成功或失败)及影像学资料(X线、CT、MRI、PET等)分3个专会场进行辨析、会诊、互动、权威点评；③workshop模拟手术操作，峰会将设置创伤、脊柱、关节(肩、肘、髋、膝、踝),3个专题会场，进行为期半天的workshop模拟手术操作示教；④手术演示实况转播，选择脊柱、创伤2个经典病例，由美方专家主刀手术，分2个会场实况同步直播，亲临感受国际骨科大师的顶级手术技艺。所有课程均设同声传译，语言障碍自然无忧。

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DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.02.07

通信作者：张先龙E-mail: 2324173807@qq.com

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